Summary
We presenteren een nieuwe en krachtige integratie van nanofotonica (QD-FRET) en microfluidics tot de vorming van polyelektrolyt polyplexes, die naar verwachting een betere controle en de synthese van een uniforme en aanpasbare polyplexes voor toekomstige op nucleïnezuur gebaseerde therapieën te onderzoeken.
Abstract
Ontwikkelingen in genomics blijven de ontwikkeling van therapeutica die pathogenese kan richten op cellulair en moleculair niveau brandstof. Meestal functioneel in de cel, op nucleïnezuur gebaseerde therapieën vereisen een efficiënt intracellulaire leveringssysteem. Een algemeen aanvaarde benadering is om complexe DNA met een gen drager nanocomplexes via elektrostatische zelf-assemblage vorm, het vergemakkelijken van cellulaire opname van DNA en beschermt het tegen degradatie. De uitdaging ligt in het rationeel ontwerp van efficiënte gendragers, omdat vroegtijdige dissociatie of overdreven stabiel bindend zou schadelijk zijn voor de cellulaire opname en de therapeutische werkzaamheid. Nanocomplexes gesynthetiseerd door het mengen van bulk liet een breed scala van intracellulaire uitpakken en mensenhandel gedrag, wat werd toegeschreven aan de heterogeniteit in omvang en stabiliteit van nanocomplexes. Dergelijke heterogeniteit bemoeilijkt een nauwkeurige vaststelling van de zelf-assemblage kinetiek en draagt bij aan de moeilijkheid correlerende hun fysieke eigenschappen aan transfectie efficiëntie of bioactivities. Wij presenteren een nieuwe convergentie van nanofotonica (dat wil zeggen QD-FRET) en microfluidics om de real-time kinetiek van de nanocomplex zelf-assemblage karakteriseren onder laminaire stroming. QD FRET-biedt een zeer gevoelige indicatie van het begin van de moleculaire interacties en kwantitatieve meten gedurende het proces van synthese, terwijl microfluidics biedt een goed gecontroleerde micro-omgeving van het proces ruimtelijk te analyseren met een hoge temporele resolutie (~ milliseconden). Voor het model systeem van polymere nanocomplexes, werden twee verschillende fasen in het zelf-assemblage proces gevangen door deze analytische platform. De kinetische aspect van de zelf-assemblage, verkregen bij de microschaal zou bijzonder waardevol voor microreactor-based reacties die relevant zijn voor een groot aantal micro-en nano-schaal toepassingen. Verder kan nanocomplexes worden aangepast door een goede vormgeving van microfludic apparaten, en de daaruit voortvloeiende QD-FRET polymere DNA nanocomplexes kan direct worden toegepast voor het vaststellen van structuur-functie relaties.
Protocol
A. biotinylatie van DNA
Plasmide DNA werden covalent gebiotinyleerd met guanine-specifieke biotine labels zoals beschreven door de fabrikant (Mirus Bio, Madison, WI), maar geschaald naar ~ 1-2 biotine labels per DNA hebben. Plasmide DNA (pEGFP-C1, 4,9 kb, Clontech, Mountain View, CA) werd gelabeld in dit protocol.
- Los gewenste hoeveelheid pDNA in de TE-buffer van DNase-vrij en RNase-vrij (moleculaire biologie-grade kwaliteit) water tot een 1μg/μL DNA-oplossing te maken.
- Gedrag op het etiket reactie met behulp van de volgende reactie mengsels. Voeg de Label IT-reagens duren.
Voor 100μg DNA reactie:
| DNase-vrij en RNase-vrij water | 75 pi |
| 10X Labeling Buffer A | 20 pi |
| 1μg/μL DNA | 100 ul |
| Label IT reagens | 5 microliter |
| Totaal Volume | 200 pi |
- Incubeer de reactie bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Zuiveren het label monster met ethanol of isopropanol precipitatie volgende standaard protocollen.
Let op: Gel filtratie op basis van kolommen kan leiden tot hoge UV-absorptie of fluorescentie achtergrond, die het DNA kwantificering of fluorescentie karakterisering van invloed kunnen zijn.
Opmerking: Het niveau van biotinylatie kan worden bepaald door HABA-gebaseerde testen.
B. Etikettering van de Cy5-kationische polymeer
Chitosan (390 kDa, 83,5% gedeacetyleerd, Vanson, Redmond, WA) werd gebruikt als een model kationisch polymeer in deze studie. De vrije primaire amines op de chitosan polymeerskelet werden gemerkt met Cy5-NHS (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
- Ter bevordering van volledige vervoeging van Cy5 kleurstof, het berekenen van de benodigde hoeveelheid Cy5-NHS zodanig dat de molaire verhouding van Cy5: primaire amines is 1: 200.
- Regel de pH van de chitosan-oplossing (in 25 mm acetaat buffer) tot ~ 6,5 door toevoeging van NaOH. Merk op dat de NHS reactie is efficiënter bij basische pH, maar de oplosbaarheid van chitosan hier beperkt het werk pH-bereik.
- Al roerend, voeg langzaam de berekende hoeveelheid van Cy5-NHS (1 mg / ml DMSO) aan de chitosan-oplossing in een drop-door-drop manier.
- Schud het mengsel in het donker bij kamertemperatuur gedurende de nacht.
- Te zuiveren, dialyze met 10k MWCO Slide-a-Lyzer (Pierce) voor 2 uur tegen 1% acetaat buffer bij kamertemperatuur in het donker.
- Vervang de buffer en nog eens 2 uur dialyze bij kamertemperatuur in het donker.
- Vervang de buffer en dialyze overnacht bij 4 ° C in het donker.
- Store gezuiverd gelabeld polymeer bij -20 ° C.
Opmerking: In deze studie, een standaard curve wordt geconstrueerd door het meten van de emissie-intensiteit van de Cy5-NHS ester op 670 nm. Karakteriseren de etikettering dichtheid door het meten van de verkregen emissie bij 670 nm van Cy5-gelabelde chitosan in de standaard curve. Absorptie kan ook worden gebruikt voor de etikettering efficiëntie te bepalen, maar was hier niet uitgevoerd.
C. Voorbereiding van de QD-gelabeld DNA en Cy5-Polymer
De molaire verhouding van pDNA aan QD werd gehouden werden (pDNA: QD ≈ 1: 2) om volledige vervoeging van QD's te pDNA te verzekeren. Het aantal QDs label op elk pDNA kan worden geschat door middel van TEM beeldvorming of een andere gelijkwaardige voorzieningen. In onze studie, is het aantal QDs per pDNA naar schatting ~ 1-3 door TEM en single molecule spectroscopie. Gebruik een Millipore Milli-Q gradiënt water (> 18,0 MW, 0.2um gefilterd) tijdens de voorbereiding.
- Het berekenen van de benodigde hoeveelheid chitosan voor 10μg pDNA op basis van de gewenste N / P ratio, de theoretische verhouding van geprotoneerd amines in de chitosan-oplossing om de negatieve fosfaten in de DNA-oplossing.
- Add-streptavidine gefunctionaliseerde 605QDs (Qdot 605 ITK, Invitrogen, Carlsbad, CA) in de gebiotinyleerd pDNA oplossing.
- Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 15 minuten.
- Voeg de QD-gelabeld DNA in 50 mM natrium-sulfaat oplossing voor het uiteindelijke volume 200μL te maken.
- Verdunnen Cy5-chitosan, volgens de gewenste N / P ratio, met Milli-Q water tot de uiteindelijke volume 200μL te maken.
Let op: Houd de reactie in het donker om mogelijke fotobleken te voorkomen.
Belangrijk: Wees voorzichtig aan de Qdot 605 ITK ™ streptavidine conjugaat (de ITK-serie), zoals Quantum dots in deze catalogus zijn ontworpen met het oog op FRET gebruiken. De reguliere Qdot serie zijn geconjugeerd met een PEG laag om niet-specifieke binding te voorkomen, in het bijzonder voor cellulaire etikettering. Echter, deze extra coating vergroot de donor-acceptor afstand, wat resulteert in reduced energie-overdracht-efficiëntie.
D. Fabricage van de SU-8 Masters gebruik van standaard Fotolithografie
- Si wafer is piranha schoongemaakt en gebakken bij 200 ° C gedurende 5 minuten.
- Voor de aangewezen meester dikte van 25μm, spin coat de negatieve fotoresist (SU-8 2025, Microchem, Newton, MA) op Si wafer bij 2000 rpm gedurende 30 sec.
- Zacht bakken van de wafer op een kookplaat met een helling van 65 ° C / uur tot 95 ° C.
- Blootstellen aan UV-licht (365nm) voor 250mJ/cm 2 tot en met een masker film (CAD / Art Services, Bandon, OR) met daarin het ontwerp van microkanalen.
- Post-exposure bakken van de wafer op een kookplaat met een helling van 65 ° C / uur tot 95 ° C.
- De ontwikkeling van de wafer met behulp van SU-8 fotolak ontwikkelaar.
- Het patroon wafer is hard gebakken op een kookplaat met een helling van 65 ° C / uur tot 200 ° C. Handhaving van de wafer op 200 ° C gedurende ten minste vijf uur, daarna geleidelijk afkoelen van de wafer tot kamertemperatuur.
Belangrijk: Geleidelijke aanloop tijdens de SU-8 meester bakproces is noodzakelijk, anders wordt de SU-8 structuur kan los van de silicium wafer of scheuren op de SU-8 structuur kan worden veroorzaakt door stress-release.
E. Replica Molding van PDMS van de meesters en binding aan de Dekglas
- De SU-8 master is geplaatst in een gewicht van boot.
- Mix silicone elastomeer en verharder (Poly (dimethylsiloxaan), PDMS, Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) in een 10: 1-ratio.
- Giet het mengsel PDMS op de SU-8 meester en laat het wegen boot in een vacuüm exsiccator om bellen te verwijderen.
- Cure de PDMS bij 65 ° C gedurende 1-2 uur.
- Schil de PDMS strip van de Si meester mal.
- Punch kanaal inlaten en uitlaten van de vloeibare apparaat.
- Reinig de PDMS strip en dekglas met ethanol en vervolgens aan de lucht drogen.
- Behandel de gereinigde PDMS strip en dekglas met zuurstof plasma (20 W voor 1 minuut).
- Onmiddellijk bond de PDMS strip met deksel glas.
- Laat de gebonden microfluïdische chip in de oven op 95 ° C voor de overnachting.
Belangrijk: Plasma behandeling en 's nachts bakken zijn essentieel voor betere hechting.
F. Monitor de vorming van DNA Nanocomplexes In de Microfluïdische Device
- Vul de microfluïdische kanaal met water (om te zorgen dat er geen luchtbellen in de microfluïdische kanaal), voor het laden van de reagentia te vlotte doorstroming te verzekeren tijdens het experiment.
- Laad de QD-gelabeld DNA en Cy5-gelabelde chitosan oplossingen in twee afzonderlijke glazen spuiten, door de slang die in de video.
- Sluit de slang met de twee inhammen van microfluïdische apparaten. Wees voorzichtig dat er geen lucht aan te voeren tijdens het proces. Stel het debiet bij 20nL/min (PHD-2000 spuit pomp, Holliston, MA), onder laminaire stroming.
- Controleer de microkanalen onder de microscoop.
- Wanneer de stroom is stabiel (~ 15 tot 20 minuten), QD-gemedieerde FRET moeten worden geobserveerd in het midden van het kanaal.
- Neem fluorescentie foto's (gekoelde CCD, Qimaging, BC, Canada) op verschillende locaties langs het kanaal.
- Analyseer de fluorescentie beelden met ImageJ en OriginLab.
Figuur 1. QD FRET-biedt een gevoelige indicatie van het begin van de DNA Nanocomplexes zelf-assemblage
- Quantum dot-gemedieerde fluorescentie resonantie energie-overdracht (QD-FRET) kan zorgen voor een kwantitatief en zeer gevoelige indicatie van Polyplex stabiliteit in zowel extra-of intra-cellulaire omgevingen, waardoor eenduidige detectie van het begin van de interacties tussen DNA en het gen drager. De FRET paar, 605QD en Cy5, werd gekozen op basis van het maximaliseren van spectrale overlap tussen de donor en acceptor en het minimaliseren van mogelijke cross-talk. Voor dit paar, de Förster afstand 69.4Å. 3
- Zelf-assemblage van de QD-FRET DNA nanocomplexes. Anionische plasmide DNA (pDNA) en de kationische-gen drager werden gemerkt met QD (energie donor) en Cy5 (energie acceptor), respectievelijk. QD-FRET nanocomplexes werd gevormd door middel van elektrostatische complex coacervatie. Bij excitatie bij 488 nm, QD-FRET-gemedieerde Cy5 emissie aangegeven de vorming van een compacte en intact nanocomplex. De verblijftijd (t R) kan worden berekend op basis van de afstand (x) welke maatregelen uit waar de twee stromen bijeen om de positie van de reactie wordt onderzocht, en de gemiddelde doorstroomsnelheid (v). Vanwege de aard van de laminaire stroming, menging vindt alleen plaats via de interface (midden van elke afbeelding), waardoor nauwkeurige berekening van de massa transport als functie van t R. Temporele resolutie kan worden aangepast door het variëren van de applied debiet. (Inzet) FRET-gemedieerde signaal werd onmiddellijk waargenomen op de interface als de twee stromen gehaald, wat aangeeft dat bindende snelle was, die binnen een paar milliseconden volgens de toegepaste debieten. Schaal Bar: 100 urn.
Discussion
- Betekenis van ons werk:
- Dit is de eerste poging om polymere DNA nanocomplex zelf-assemblage kinetiek in real-time (milliseconden resolutie) controleren door middel van QD-FRET respons binnen een eenvoudige microfluïdische chip.
- QD-gemedieerde FRET zorgt voor een zeer gevoelige en kwantitatieve indicatie van het begin van de moleculaire interacties en in de zelf-assemblage proces, terwijl microfluidics biedt een goed gecontroleerde micro-omgeving aan het proces ruimtelijk te analyseren tijdens de DNA-synthese nanocomplex.
- De integratie van microfluidics en nanofotonica suggereert een nieuwe en interessante benadering voor elk type van complexatie reacties te onderzoeken.
- De resulterende QD-FRET polymere DNA nanocomplexes kan direct worden toegepast voor het vaststellen van structuur-functie relaties. 1,2
Acknowledgments
Financiering ondersteuning door NIH subsidie HL89764, NSF verleent 0546012, 0730503 en 0725528.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 | MicroChem Corp. | SU-8 2025 | |
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Plasmid DNA | Clontech Laboratories | pEGFP-C1 | 4.9 kb, MW = 3.3 x 106 |
| LabelIT Biotin Labeling Kit | Mirus Bio LLC | MIR 3400 | Standard protocol yields labeling efficiency of approximately one label every 20-60 bp of double-stranded DNA, The density of labeling was adjusted in this work. |
| Streptavidin 605QD | Invitrogen | Qdot® 605 ITK® Streptavidin Conjugate | |
| Cy5-NHS Ester | Amersham | PA15101 | |
| Chitosan | Vanson | 390 kDa | 83.5% deacetylated |
| Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545C | No. 1; Size: 40 x 22mm |
| Gastight Glass Syringe | Hamilton Co | TLL series | 50μL to 500μL depending on sample volume |
| Tygon Tubing | Small Parts, Inc. | 0.02 ID, 100ft | Tygon Tubes Microbore, 0.02 ID, 100ft |
| Connector | Small Parts, Inc. | HTX-23R | Customized in length of 0.750" |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD-2000 | |
| CCD | QImaging | Intensified Retiga Cooled | |
| Microscope | Olympus Corporation | BX-51 | 100W mercury arc lamp |
| ImageJ | National Institutes of Health | v1.36b | http://rsb.info.nih.gov/ij |
| Origin Pro8 | OriginLab | Student Version | |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 475AF40 | Excitation filter in both channels |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595AF60 | Emission filter in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 670DF40 | Emission filter in QD-FRET channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 500 DRLP | Long pass dichroic in 605QD channel |
| Microscope Filter sets | Omega Optical | 595DRLP | Long pass dichroic in QD-FRET channel |
References
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. J Control Release. 116, 83-89 (2006).
- Chen, H. H. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum dot-FRET. Mol. Ther. 16, 324-332 (2008).
- Zhang, C. Y., Yeh, H. C., Kuroki, M., Wang, T. H.
