Summary

Een protocol voor de productie van KLRG1 tetrameer

Published: January 12, 2010
doi:

Summary

Dit protocol beschrijft de productie van KLRG1 tetrameer, dat is een krachtig hulpmiddel voor de analyse van KLRG1 liganden.

Abstract

Killer cell lectine-like receptor G1 (KLRG1) is een type II transmembraan glycoproteïne remmende receptor die behoren tot de C-type lectine-achtige superfamilie. KLRG1 bestaat zowel als een monomeer en als een disulfide-linked homodimeer. Deze goed bewaard gebleven receptor is te vinden op het meest volwassen en recent geactiveerde NK-cellen als op een subset van effector / geheugen T-cellen.

Met behulp van KLRG1 tetrameer evenals andere methoden, E-, N-en R-cadherines werden geïdentificeerd als KLRG1 liganden. Deze Ca 2 +-afhankelijke cel-cel adhesie moleculen bestaat uit een extracellulair domein met vijf cadherine herhalingen verantwoordelijk zijn voor cel-cel interacties, een transmembraan domein en een cytoplasmatisch domein dat gekoppeld is aan het actine cytoskelet.

Generatie van de KLRG1 tetrameer was essentieel voor de identificatie van de KLRG1 liganden. KLRG1 tetrameer is ook een uniek hulpmiddel om de rollen cadherine en KLRG1 spelen toe te lichten bij het reguleren van de immuunrespons en weefsel integriteit.

Protocol

Voorbereiding van de insluitingslichamen Inoculeren 4 x 500 ml flesjes van TB elk met 50 ug / ml carbenicilline en chlooramfenicol met een overnachting cultuur van bacteriën de uiting van de KLRG1 plasmide bouwen. Wanneer de OD 0.6 Å bereikt bij 600 nm, braken met de toevoeging van 0,4 M IPTG en de cultuur voor een extra 4 uur schudden geïncubeerd bij 37 ° C. Resuspendeer de geoogste cellen in resuspensie buffer pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 25% (W / V) sucrose, 1 mM EDTA, 10 mM DTT). Let op: pellet…

Discussion

In dit protocol wordt aangetoond hoe te zuiveren, biotinylate, en tetramerize KLRG1. KLRG1 tetrameer kan worden gebruikt om KLRG1 liganden label door flowcytometrie. Hoewel hervouwing voorwaarden moeten empirisch worden getest op elk eiwit, kunnen andere C-type lectines worden tetramerized met behulp van een soortgelijk protocol. Met behulp van tetramerized eiwitten als probes, liganden van verweesde C-type lectine receptoren zou kunnen worden geïdentificeerd.

Acknowledgements

Wij danken dr. Naidenko voor hulp bij het optimaliseren van de hervouwing voorwaarden. Dit werk werd ondersteund door NIH onderzoek te verlenen AI58181 aan Laurent Brossay. Cindy Banh wordt ondersteund door NIH NRSA F31 AI080230.

Stephanie Terrizzi en Cindy Banh een gelijkwaardige bijdrage aan dit werk.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
BirA Enzyme and Buffer Biotinylation Kit Avidity BIRA500  
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free Reagent Roche 11 836 170 001 or equivalent
Amicon Stirred Cell Equipment Millipore Model #8400 or equivalent
YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane Filtration Supply Millipore 13642  
15 ml YM10 concentrator Filtration Supply Millipore 4411  
AKTAFPLC Equipment GE Healthcare 18-1900-26  
Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column Equipment GE Healthcare 17-1166-01  
Strepavidin PE Reagent BD Biosciences 554061 or equivalent

References

  1. Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
  2. Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
  3. Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
  4. Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
  5. Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , .
check_url/fr/1701?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
Terrizzi, S. C., Banh, C., Brossay, L. A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer. J. Vis. Exp. (35), e1701, doi:10.3791/1701 (2010).

View Video