Un protocolo para la producción de KLRG1 Tetramer
Summary
Este protocolo describe la producción de KLRG1 tetrámero, que es una poderosa herramienta para el análisis de KLRG1 ligandos.
Abstract
Las células asesinas tipo lectina G1 receptor (KLRG1) es un tipo de receptores transmembrana II glicoproteína inhibitoria que pertenecen al tipo C-lectina como superfamilia. KLRG1 existe como monómero y como un homodímero disulfuro-ligado. Este receptor, bien conservada se encuentra en las células NK más madura y activa recientemente, así como en un subconjunto de células T efectoras / memoria.
Utilizando KLRG1 tetrámero, así como otros métodos, E, N, R y-cadherinas fueron identificados como KLRG1 ligandos. Estos Ca 2 +-dependiente de la célula-célula moléculas de adhesión forma parte de un dominio extracelular que contiene cinco repeticiones cadherina responsables de las interacciones célula-célula, un dominio transmembrana y un dominio citoplasmático que se vincula con el citoesqueleto de actina.
Generación del tetrámero KLRG1 era esencial para la identificación de los KLRG1 ligandos. KLRG1 tetrámero es también una herramienta única para dilucidar la cadherina roles y jugar KLRG1 en la regulación de la respuesta inmune y la integridad del tejido.
Protocol
Discussion
En este protocolo, se muestra cómo purificar, biotinylate y KLRG1 tetramerize. KLRG1 tetrámero puede ser utilizada para etiquetar KLRG1 ligandos por citometría de flujo. Aunque las condiciones de replegamiento tendrá que ser probado empíricamente para cada proteína, otras de tipo C-lectinas podrían ser tetramerized utilizando un protocolo similar. El uso de proteínas tetramerized como sondas, los ligandos para los receptores de lectina tipo huérfano C-podrían ser identificados.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Naidenko para ayudar en la optimización de las condiciones de replegamiento. Este trabajo fue apoyado por el NIH beca de investigación AI58181 a Laurent Brossay. Cindy Banh es apoyado por el NIH AI080230 NRSA F31.
Stephanie Terrizzi y Banh Cindy contribuyen igualmente a este trabajo.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
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