KLRG1テトラマーの生産のためのプロトコル
Summary
このプロトコルは、KLRG1リガンドの分析のための強力なツールですKLRG1四量体、の製造を説明します。
Abstract
キラー細胞レクチン様受容体のG1（KLRG1）はC型レクチン様スーパーファミリーに属するII型膜貫通糖タンパク質抑制性受容体である。 KLRG1は、モノマーとして、及びジスルフィド結合ホモダイマーとしても存在する。このよく保存された受容体は、最も成熟し、最近では活性化NK細胞だけでなく、エフェクター/メモリーT細胞のサブセットに記載されています。
KLRG1四量体だけでなく、他の方法を使用して、E -、N -、およびR -カドヘリンはKLRG1リガンドとして同定された。これらのCa 2 +依存性細胞間接着分子は細胞間相互作用、膜貫通ドメインとアクチン細胞骨格にリンクされている細胞質ドメインの責任fiveカドヘリンリピートを含む細胞外ドメインで構成する。
KLRG1四量体の生成はKLRG1リガンドの同定に不可欠でした。 KLRG1四量体はまた、免疫応答と組織の整合性の調節に役割のカドヘリンとKLRG1プレイを解明するユニークなツールです。
Protocol
Discussion
このプロトコルでは、ビオチニル化する、精製する方法が示され、tetramerize KLRG1ている。 KLRG1四量体はフローサイトメトリーでKLRG1リガンドを標識するために使用することができます。リフォールディング条件は各タンパク質のために経験的にテストされる必要があるものの、他のC型レクチンは、同様のプロトコルを使用してtetramerizedすることができます。プローブとしてtetramerizedタンパク?…
Acknowledgements
我々は、リフォールディング条件を最適化することで助けを博士Naidenkoに感謝。この作品は、ローランBrossayにNIHの研究助成金AI58181によってサポートされていました。シンディあるbanhはNIH NRSA F31 AI080230によってサポートされています。
ステファニーTerrizziとシンディあるbanhはこの作品にも同様に寄与する。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , .
