KLRG1 Tetramer의 생산을위한 프로토콜
Summary
이 프로토콜은 KLRG1 리간드의 분석을위한 강력한 도구입니다 KLRG1 tetramer의 생산을 설명합니다.
Abstract
킬러 세포 렉틴 같은 수용체 G1 (KLRG1)은 C 타입 렉틴 같은 superfamily에 속하는 유형 II의 transmembrane의 당단백질 수용체 억제합니다. KLRG1는 단량체로서 이황화 결합 homodimer로 모두 존재합니다. 이 잘 보존되어 수용체가 가장 성숙하고 최근에 활성화된 NK 세포에서뿐만 아니라 효과기 / 메모리 T 세포의 일부에서 발견됩니다.
KLRG1 tetramer뿐만 아니라 다른 방법을 사용하여, E -, N – 및 R – cadherins은 KLRG1 리간드로 확인되었습니다. 이러한 칼슘 2 +에 의존 세포 – 세포 부착 분자는 세포 – 세포 상호 작용, transmembrane 도메인과 굴지의 cytoskeleton에 연결된 세포질 도메인에 대해 책임을 다섯 cadherin의 반복을 포함하는 세포외 도메인에 구성되어 있습니다.
KLRG1 tetramer의 생성은 KLRG1 리간드의 식별에 필수되었습니다. KLRG1 tetramer 또한 면역 반응 및 조직 무결성을 규제의 역할 cadherin과 KLRG1 재생을 명료하게하다 수있는 유일한 도구입니다.
Protocol
Discussion
이 프로토콜에서는, 그것은 biotinylate, 정화하는 방법을 표시하고, tetramerize KLRG1입니다. KLRG1 tetramer는 유동세포계측법로 KLRG1 리간드 레이블을 사용할 수 있습니다. refolding 조건이 각각의 단백질에 대해 경험적으로 테스트해야되지만, 다른 C – 타입 lectins은 유사한 프로토콜을 사용 tetramerized 수 있습니다. 프로브, 고아 C – 타입 렉틴 수용체에 리간드로 tetramerized 단백질을 사용하면 잠재적으로 식별 ?…
Acknowledgements
우리는 refolding 조건을 최적화에 대한 도움 박사 Naidenko 감사합니다. 이 작품은 로랑 Brossay에 NIH 연구 부여 AI58181에 의해 지원되었다. 신디 반은 NIH NRSA F31 AI080230에 의해 지원됩니다.
스테파니 Terrizzi와 신디 반이 작품에 동등하게 기여하고 있습니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| BirA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free | Reagent | Roche | 11 836 170 001 | or equivalent |
| Amicon Stirred Cell | Equipment | Millipore | Model #8400 | or equivalent |
| YM10 NMWL 10K ultrafiltration membrane | Filtration Supply | Millipore | 13642 | |
| 15 ml YM10 concentrator | Filtration Supply | Millipore | 4411 | |
| AKTAFPLC | Equipment | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Sephacryl S-200 16/60 high-resolution column | Equipment | GE Healthcare | 17-1166-01 | |
| Strepavidin PE | Reagent | BD Biosciences | 554061 | or equivalent |
References
- Tessmer, M. S., Fugere, C., Stevenaert, F., Naidenko, O. V., Chong, H. J., Leclercq, G., Brossay, L. KLRG1 binds cadherins and preferentially associates with SHIP-1. Int Immunol. 19, 391-400 (2007).
- Grundemann, C., Bauer, M., Schweier, O., von Oppen, N., Lassing, U., Saudan, P., Becker, K. F., Karp, K., Hanke, T., Bachmann, M. F., Pircher, H. Cutting edge: identification of E-cadherin as a ligand for the murine killer cell lectin-like receptor G1. J Immunol. 176, 1311-1315 (2006).
- Ito, M., Maruyama, T., Saito, N., Koganei, S., Yamamoto, K., Matsumoto, N. Killer cell lectin-like receptor G1 binds three members of the classical cadherin family to inhibit NK cell cytotoxicity. J Exp Med. 203, 289-295 (2006).
- Li, Y., Hofmann, M., Wang, Q., Teng, L., Chlewicki, L. K., Pircher, H., Mariuzza, R. A. Structure of natural killer cell receptor KLRG1 bound to E-cadherin reveals basis for MHC-independent missing self recognition. Immunity. 31, 35-46 (2009).
- Nakamura, S., Kuroki, K., Ohki, I., Sasaki, K., Kajikawa, M., Maruyama, T., Ito, M., Kameda, Y., Ikura, M., Yamamoto, K., Matsumoto, N., Maenaka, K. K. Molecular basis for E-cadherin recognition by killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1). J Biol Chem. , .
