Detta protokoll beskriver produktionen av KLRG1 tetramer, som är ett kraftfullt verktyg för analys av KLRG1 ligander.
Abstract
Killer cell lektin-like receptor G1 (KLRG1) är en typ II transmembrant glykoprotein hämmande receptor som tillhör C-typ lektin-liknande superfamiljen. KLRG1 finns både som monomer och som disulfide-linked homodimer. Denna väl bevarade receptorn finns på de mest mogna och nyligen aktiverade NK-celler samt på en delmängd av effektor / minne T-celler.
Använda KLRG1 tetramer såväl som andra metoder, E-, N-och R-cadherins identifierades som KLRG1 ligander. Dessa Ca2 +-beroende cell-cell adhesionsmolekyler består av en extracellulär domän som innehåller fem cadherin upprepar ansvarig för cell-cell interaktioner, en transmembranös domän och ett cytoplasma domän som är kopplad till aktin cytoskelettet.
Generationen av KLRG1 tetramer var viktigt att identifieringen av KLRG1 ligander. KLRG1 tetramer är också ett unikt verktyg för att belysa de roller cadherin och KLRG1 spela i regleringen av immunförsvaret och vävnaden integritet.
Protocol
Beredning av inklusionskroppar Inokulera 4 x 500 ml kolvar av TB var och en innehåller 50 mikrogram / ml Carbenicillin och kloramfenikol med en övernattning kultur av bakterier uttrycka KLRG1 plasmiden konstruera. När OD når 0,6 A vid 600 nm, framkalla med tillägg av 0,4 M IPTG och inkubera kulturen i ytterligare 4 timmar skaka vid 37 ° C. Resuspendera skördas cellerna i resuspension pH = 8,0 (50 mM Tris-HCl, 25% (w / v) sackaros, 1 mM EDTA, 10 mm DTT). Obs: pellets kan frysas i detta skede. …
Discussion
I detta protokoll, visas det hur man kan rena, biotinylate och tetramerize KLRG1. KLRG1 tetramer kan användas för att märka KLRG1 ligander med flödescytometri. Trots att vika villkor kommer att testas empiriskt för varje protein kan andra C-typ lektiner vara tetramerized med ett liknande protokoll. Använda tetramerized proteiner som prober, ligander till föräldralösa C-typ lektin receptorer skulle kunna identifieras.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Naidenko om hjälp med att optimera vika förhållanden. Detta arbete stöddes av NIH forskningsanslag AI58181 till Laurent Brossay. Cindy Banh stöds av NIH NRSA F31 AI080230.
Stephanie Terrizzi och Cindy Banh bidra lika mycket till detta arbete.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
BirA Enzyme and Buffer
Biotinylation Kit
Avidity
BIRA500
Complete Mini Protease Inhibitor Tablets, EDTA Free