Primaire menselijke bronchiale epitheelcellen gegroeid van Explantaten
Summary
Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor het kweken van primaire menselijke bronchiale epitheelcellen van explantaten van menselijke bronchiale luchtwegen weefsel inclusief gedifferentieerde groei van een lucht-water grensvlak. Deze methode biedt een overvloedige bron van primaire cellen voor onderzoek naar de rol van de luchtweg epitheel in de menselijke longen gezondheid en ziekte.
Abstract
Menselijke bronchiale epitheelcellen nodig zijn voor cel-modellen van de ziekte en het effect van hulpstoffen en farmacologische agenten op de functie en structuur van de menselijke epitheelcellen te onderzoeken. Hier beschrijven we in detail de kweekmethode bronchiale epitheelcellen van de luchtwegen luchtwegen weefsel dat wordt door de chirurg geoogst op de tijden van de longchirurgie (bv. longkanker of long volume reductie chirurgie). Met ethiek goedkeuring en informed consent, de chirurg neemt wat nodig is voor de pathologie en voorziet ons van een bronchiale gedeelte dat is ver van de zieke gebieden. Het weefsel wordt vervolgens gebruikt als een bron van explanten die kan worden gebruikt voor het kweken van primaire bronchiale epitheelcellen in de cultuur. Bronchiale segmenten ongeveer 0,5-1cm lang en 1 cm in diameter ≤ worden gespoeld met koud EBSS en overtollige parenchymweefsel wordt verwijderd. Segmenten zijn opengesneden en gehakt in de 2-3mm<sup> 3</sup> Stukjes weefsel. De stukken worden gebruikt als een bron van primaire cellen. Na het coaten 100mm kweekplaten voor 1-2 uur met een combinatie van collageen (30 ug / ml), fibronectine (10 ug / ml), en de BSA (10 ug / ml), worden de platen gekrast in 4-5 gebieden en weefsel stukken worden geplaatst in de krassen gebieden, dan kweekmedium (DMEM / Ham F-12 met additieven) die geschikt zijn voor epitheliale celgroei wordt toegevoegd en de platen worden geplaatst in een incubator bij 37 ° C in 5% CO<sub> 2</sub> Bevochtigde lucht. Het kweekmedium wordt elke 3-4 dagen. De epitheliale cellen groeien uit de stukken de vorming van ongeveer 1,5 cm diameter ringen in 3-4 weken. Explanten kan opnieuw worden gebruikt tot 6 keer door ze te verplaatsen naar nieuwe pre-gecoate platen. Cellen worden opgeheven met behulp van trypsine / EDTA, samengevoegd, geteld, en opnieuw uitgeplaat in T75 Cell Bind kolven om hun aantal te verhogen. T75 kolven gezaaid met 2-3 miljoen cellen groeien naar 80% confluentie in 4 weken. Uitgebreide primaire menselijke epitheliale cellen kunnen worden gekweekt en toegestaan om te differentiëren op de lucht-vloeistof interface. Hier beschreven methoden bieden een overvloedige bron van menselijke bronchiale epitheelcellen van vers geïsoleerde weefsels en zorgen voor het bestuderen van deze cellen als modellen van ziekte en voor farmacologie en toxicologie screening.
Protocol
Discussion
In deze studie hebben we gepresenteerd gedetailleerde methoden voor cultuur en uitbreiding van de primaire menselijke bronchiale epitheelcellen. We laten zien hoe explantaten en transplantaties van bronchiale weefsel, gekweekt in media die epitheliale celgroei te bevorderen, kan een continue bron van menselijke epitheelcellen voor studies van de niet-gesplitste (onder water) en gedifferentieerde (gekweekt op lucht-water grensvlak) cel-modellen bieden . Deze cellen kunnen worden gebruikt in drug het testen van systemen d…
Acknowledgements
De auteurs zijn zeer dankbaar dat dr. Richard Inculet voor het verstrekken van de bronchiale weefsels. Onderzoek Ethics Board goedkeuringen zijn verkregen van St. Joseph's Gezondheidszorg Hamilton en The University of Western Ontario / Londen Health Sciences Centre (Dr. David McCormack), weefsel-en Archief Comite, afdeling Pathologie. We danken ook Ernie Spitzer (Electron Microscopy, McMaster University) voor het leveren van TEM van onze ALI culturen en Daniela Farkas voor het verstrekken van een deel van de materialen die nodig zijn voor de immunokleuring. Dit werk werd gefinancierd door een Block term subsidie van de Ontario Thoracic Society, dr. Asma Yaghi werd ondersteund door een FSORC beurs, St. Joseph's Healthcare, Hamilton, Ontario, Canada.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma | A4919 | Use for coating solution | |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma | C8919 | Use for coating solution | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma | F2006 | Use for coating solution | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution | |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma | D8437 | ||
| FBS | Sigma | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | BSA | |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma | P1476 | BPE | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | EGF | |
| (±)-Epinephrine | Sigma | E1635 | ||
| Insulin | Sigma | I6634 | ||
| Tranferrin Human | Sigma | T8158 | ||
| Triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | ||
| Hydorcortisone | Sigma | H0888 | ||
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | ||
| Trypsin | Sigma | T9935 | ||
| EDTA | Sigma | E6758 | EDTA | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P5368 | PBS | |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | |||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | ||
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth | |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution | |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma- Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution | |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody | |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma- Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa-Cruz | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody | |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa-Cruz | Use 1:100 dilution | ||
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence during prolonged storage | |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage | |
| Hoechst Stain solution | Sigma | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.
References
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts – Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. v. a. n. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. . Culture of epithelial cells. , 1-23 (1992).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. , 181-196 (1992).
