Primario cellule epiteliali bronchiali umane Grown da espianti
Summary
Qui si descrive un metodo dettagliato per la coltivazione primaria cellule epiteliali bronchiali umane da espianti di tessuti umani delle vie aeree bronchiali tra cui la crescita differenziati su un aria-liquido. Questo metodo fornisce una fonte abbondante di cellule primarie per indagare il ruolo dell'epitelio delle vie aeree dei polmoni umani nella salute e nella malattia.
Abstract
Cellule epiteliali bronchiali umane sono necessarie per modelli cellulari della malattia e per indagare l'effetto di eccipienti e agenti farmacologici sulla funzione e la struttura delle cellule epiteliali umane. Qui si descrivono in dettaglio il metodo di coltivazione cellule epiteliali bronchiali dal tessuto delle vie aeree bronchiali che viene raccolto dal chirurgo al momento della chirurgia polmonare (ad esempio il cancro ai polmoni o di riduzione del volume polmonare). Con l'approvazione etica e il consenso informato, il chirurgo prende ciò che è necessario per patologia e ci fornisce una porzione bronchiale che è lontano dalle zone malate. Il tessuto viene quindi utilizzato come fonte di espianti che possono essere utilizzati per la coltivazione di cellule primarie epiteliali bronchiali in coltura. Segmenti bronchiali circa 0,5-1cm di lunghezza e ≤ 1 centimetro di diametro, sono sciacquati con EBSS freddi e eccesso di tessuto parenchimale è stato rimosso. I segmenti sono tagliati aperti e tritata in 2-3mm<sup> 3</sup> Pezzi di tessuto. I pezzi sono usati come fonte di cellule primarie. Dopo piastre di coltura rivestimento 100 millimetri per 1-2 ore con una combinazione di collagene (30 mg / ml), fibronectina (10 mg / ml), e BSA (10 mg / ml), le piastre sono graffiati in zone 4-5 e tessuti i pezzi sono posti in aree graffiato, allora terreno di coltura (DMEM / Ham F-12 con additivi) adatto per la crescita delle cellule epiteliali viene aggiunto e le piastre sono poste in un incubatore a 37 ° C in 5% di CO<sub> 2</subAria> umidificata. Il terreno di coltura viene cambiato ogni 3-4 giorni. Le cellule epiteliali crescono dai pezzi che formano anelli di circa 1,5 cm di diametro in 3-4 settimane. Espianti possono essere riutilizzati fino a 6 volte spostandoli in nuovi preverniciato piatti. Le cellule sono sollevati utilizzando tripsina / EDTA, in pool, contati, e ri-placcato in fiaschi cellulare T75 Bind per aumentare il loro numero. T75 fiaschi seminato con 2-3 milioni di cellule crescono confluenza a 80% in 4 settimane. Espanse cellule primarie umane epiteliali possono essere coltivate e ha permesso di differenziare in aria-liquido. Metodi descritti qui fornire una fonte abbondante di cellule epiteliali bronchiali umane isolate da tessuti freschi e permettono di studiare queste cellule come modelli di malattie e per la farmacologia e lo screening tossicologico.
Protocol
Discussion
In questo studio abbiamo presentato i metodi dettagliati per la cultura e l'espansione delle primarie cellule epiteliali bronchiali umane. Abbiamo dimostrato come espianti e trapianti di tessuto bronchiale, colta nei media che promuovono la crescita delle cellule epiteliali, in grado di fornire una fonte continua di cellule epiteliali delle vie respiratorie umane per gli studi di non-differenziati modelli cellulari (in immersione) e differenziata (cresciuta in aria-liquido) . Queste cellule possono essere utilizzate…
Acknowledgements
Gli autori sono molto grati al dottor Richard Inculet per aver fornito i tessuti bronchiali. Ricerca etica approvazioni consiglio sono stati ottenuti da San Giuseppe Healthcare Hamilton e The University of Western Ontario / London Health Sciences Centre (Dr. David McCormack), Tissue and Archives Comitato, Dipartimento di Patologia. Ringraziamo anche Ernie Spitzer (Microscopia Elettronica, McMaster University) per aver fornito TEM delle nostre culture ALI, Farkas e Daniela per aver fornito alcuni dei materiali necessari per immunocolorazione. Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione di blocco termine dalla Società Ontario Toracica; Dr. Asma Yaghi è stato sostenuto da una borsa di studio FSORC, Sanità San Giuseppe, Hamilton, Ontario, Canada.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma | A4919 | Use for coating solution | |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma | C8919 | Use for coating solution | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma | F2006 | Use for coating solution | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution | |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma | D8437 | ||
| FBS | Sigma | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | BSA | |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma | P1476 | BPE | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | EGF | |
| (±)-Epinephrine | Sigma | E1635 | ||
| Insulin | Sigma | I6634 | ||
| Tranferrin Human | Sigma | T8158 | ||
| Triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | ||
| Hydorcortisone | Sigma | H0888 | ||
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | ||
| Trypsin | Sigma | T9935 | ||
| EDTA | Sigma | E6758 | EDTA | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P5368 | PBS | |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | |||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | ||
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth | |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution | |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma- Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution | |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody | |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma- Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa-Cruz | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody | |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa-Cruz | Use 1:100 dilution | ||
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence during prolonged storage | |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage | |
| Hoechst Stain solution | Sigma | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.
References
- Phillips, J. Growing Cells on Transwell Inserts – Tips and Techniques [Internet]. Corning Life Sciences, Technical Resources, Online Training. , (2008).
- Turi, J. L. Oxidative stress activates anion exchange protein 2 and AP-1 in airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol. Physiol. 283, L791-L798 (2002).
- Lechner, J. F., Haugen, A., McClendon, I. A., Pettis, E. W. Clonal growth of normal adult human bronchial epithelial cells in a serum-free medium. In Vitro. 18, 633-642 (1982).
- Yoshisue, H. Characterization of ciliated bronchial epithelium 1, a ciliated cell-associated gene induced during mucociliary differentiation. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 491-500 (2004).
- Wetering, S. v. a. n. Regulation of secretory leukocyte proteinase inhibitor (SLPI) production by human bronchial epithelial cells: increase of cell-associated SLPI by neutrophil elastase. J. Investig. Med. 48, 359-366 (2000).
- Tristram, D. A., Hicks, W., Hard, R. Respiratory syncytial virus and human bronchial epithelium. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 124, 777-783 (1998).
- Mattinger, C., Nyugen, T., Schafer, D., Hormann, K. Evaluation of serum-free culture conditions for primary human nasal epithelial cells. Int. J. Hyg. Environ. Health. 205, 235-238 (2002).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. . Culture of epithelial cells. , 1-23 (1992).
- Freshney, R. I., Freshney, R. I. Normal human bronchial epithelial cell cultures in Culture of specialized cells series. Culture of epithelial cells. , 181-196 (1992).
