Primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten Grown
Summary
Hier beschreiben wir eine detaillierte Verfahren zur Züchtung von primären humanen bronchialen Epithelzellen aus Explantaten des menschlichen bronchialen Atemwege Gewebe einschließlich differenzierter Wachstum auf einer Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Diese Methode bietet eine reichhaltige Quelle von primären Zellen zur Untersuchung der Rolle der Atemwegsepithel in der menschlichen Lunge Gesundheit und Krankheit.
Abstract
Menschliche bronchialen Epithelzellen sind für die Zell-Modelle von Krankheiten benötigt werden, und die Wirkung von Hilfsstoffen und pharmakologische Mittel zur Funktion und Struktur des menschlichen Epithelzellen zu untersuchen. Hier haben wir im Detail beschreiben die Methode der wachsenden bronchialen Epithelzellen der Bronchien Atemwege Gewebe, das durch den Chirurgen zu den Zeiten der Lungenchirurgie (zB Lungenkrebs oder Lungenvolumenreduktion Chirurgie) geerntet wird. Mit Ethik Genehmigung und Einwilligung, nimmt der Chirurg, was für Pathologie benötigt und bietet uns eine bronchiale Teil, der fern von der erkrankten Bereiche ist. Das Gewebe wird dann als eine Quelle der Explantate, die für den Anbau von primären bronchialen Epithelzellen in Kultur verwendet werden können verwendet. Bronchial-Segmente über 0,5-1cm lang und ≤ 1 cm im Durchmesser sind mit kaltem EBSS und überschüssiges Drüsengewebe entfernt wird gespült. Segmente sind aufgeschnitten und Hackfleisch in 2-3mm<sup> 3</sup> Gewebestücke. Die Stücke sind als Quelle von primären Zellen verwendet. Nach der Beschichtung 100mm Kultur-Platten für 1-2 Stunden mit einer Kombination aus Kollagen (30 pg / ml), Fibronektin (10 ug / ml) und BSA (10 ug / ml) werden die Platten in 4-5 Bereichen und Gewebe zerkratzt Stücke in die verkratzten Stellen platziert sind, dann Kulturmedium (DMEM / Ham F-12 mit Zusätzen) für epithelialen Zellwachstums wird hinzugefügt und die Platten werden in einem Brutschrank bei 37 ° C in 5% CO<sub> 2</sub> Befeuchtete Luft. Das Kulturmedium wird alle 3-4 Tage. Die Epithelzellen wachsen die Stücke bilden ca. 1,5 cm Durchmesser Ringe in 3-4 Wochen. Explantate kann bis zu 6-mal, indem sie in neue Pre-beschichteten Platten wieder verwendet werden. Die Zellen sind aufgehoben mit Trypsin / EDTA, gebündelt, gezählt und in T75 Zelle binden Flaschen wieder beschichtet, um ihre Zahl zu erhöhen. T75 Flaschen ausgesät mit 2-3 Millionen Zellen zu 80% Konfluenz in 4 Wochen wachsen. Expanded primären humanen epithelialen Zellen können kultiviert und dürfen auf Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche zu unterscheiden. Hier beschriebenen Methoden bieten eine reiche Quelle der menschlichen bronchialen Epithelzellen von frisch isolierten Geweben und damit für das Studium dieser Zellen als Modelle von Krankheiten und für Pharmakologie und Toxikologie-Screening.
Protocol
Discussion
In dieser Studie stellten wir detaillierte Methoden für die Kultur-und Ausbau von primären humanen bronchialen Epithelzellen. Wir haben gezeigt, wie Explantate und Transplantationen von bronchialen Gewebe, in Medien, die Epithelzellen Wachstum zu fördern kultiviert, kann eine kontinuierliche Quelle der menschlichen Epithelzellen der Atemwege für Studien nichtgetrennte (unter Wasser) und differenziert (angebaut an den Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche) Zelle Modelle bieten . Diese Zellen können in Drogentests Systeme g…
Acknowledgements
Die Autoren sind sehr dankbar, dass Dr. Richard Inculet für die Bereitstellung der bronchialen Gewebe. Research Ethics Board Genehmigungen wurden vom St. Josefs Healthcare Hamilton und der University of Western Ontario / London Health Sciences Centre (Dr. David McCormack), Tissue and Archives Committee, Department of Pathology erhalten. Wir danken auch Ernie Spitzer (Electron Microscopy, McMaster University) für die Bereitstellung von TEM unserer ALI Kulturen und Daniela Farkas für die Bereitstellung einiger der Materialien für die Immunfärbung benötigt. Diese Arbeit wurde von einem Block Begriff Zuschuss von der Ontario Thoracic Society finanziert werden; Dr. Asma Yaghi wurde durch ein Stipendium FSORC, St. Joseph Healthcare, Hamilton, Ontario, Kanada unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma | A4919 | Use for coating solution | |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma | C8919 | Use for coating solution | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma | F2006 | Use for coating solution | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution | |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma | D8437 | ||
| FBS | Sigma | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | BSA | |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma | P1476 | BPE | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | EGF | |
| (±)-Epinephrine | Sigma | E1635 | ||
| Insulin | Sigma | I6634 | ||
| Tranferrin Human | Sigma | T8158 | ||
| Triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | ||
| Hydorcortisone | Sigma | H0888 | ||
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | ||
| Trypsin | Sigma | T9935 | ||
| EDTA | Sigma | E6758 | EDTA | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P5368 | PBS | |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | |||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | ||
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth | |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution | |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma- Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution | |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody | |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma- Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa-Cruz | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody | |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa-Cruz | Use 1:100 dilution | ||
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence during prolonged storage | |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage | |
| Hoechst Stain solution | Sigma | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.
References
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