Primaire cellules épithéliales bronchiques humaines Cultivé à partir d'explants
Summary
Nous décrivons ici une méthode détaillée pour la culture primaire des cellules épithéliales bronchiques humaines à partir d'explants de tissus des voies aériennes bronchiques humaines, y compris la croissance différenciée sur une interface air-liquide. Cette méthode fournit une source abondante de cellules primaires pour enquêter sur le rôle de l'épithélium des voies aériennes dans la santé des poumons et des maladies humaines.
Abstract
Cellules épithéliales bronchiques humaines sont nécessaires pour les modèles cellulaires de la maladie et pour étudier l'effet des excipients et des agents pharmacologiques sur la fonction et la structure des cellules épithéliales humaines. Ici nous décrivons en détail la méthode de culture des cellules épithéliales bronchiques du tissu bronchique qui est récolté par le chirurgien au moment de la chirurgie du poumon (cancer du poumon par exemple ou une chirurgie de réduction du volume pulmonaire). Avec l'approbation de l'éthique et le consentement éclairé, le chirurgien prend ce qui est nécessaire pour la pathologie et nous fournit une partie bronchique qui est éloignée des zones malades. Le tissu est ensuite utilisé comme source d'explants qui peuvent être utilisés pour la culture primaire des cellules épithéliales bronchiques en culture. Segments bronchiques environ 0,5 à 1 cm de long et 1 cm de diamètre ≤ sont rincés à l'EBSS froide et l'excès de tissu parenchymateux est enlevé. Les segments sont à ciel ouvert et hachées dans 2 à 3 mm<sup> 3</sup> Des morceaux de tissu. Les pièces sont utilisées comme source de cellules primaires. Après plaques 100mm revêtement de la culture pendant 1-2 heures avec une combinaison de collagène (30 ug / ml), la fibronectine (10 ug / ml), et de la BSA (10 pg / ml), les plaques sont rayés dans les zones 4-5 et tissus les pièces sont placées dans les zones rayé, puis un milieu de culture (DMEM / Ham F-12 avec des additifs) adapté à la croissance des cellules épithéliales est ajouté et les plaques sont placées dans une étuve à 37 ° C dans 5% de CO<sub> 2</sub> L'air humidifié. Le milieu de culture est changé tous les 3-4 jours. Les cellules épithéliales se développer à partir des pièces formant les anneaux d'environ 1,5 cm de diamètre dans les 3-4 semaines. Explants peuvent être réutilisées jusqu'à 6 fois en les déplaçant dans de nouvelles plaques pré-enduites. Les cellules sont levées à l'aide de trypsine / EDTA, mis en commun, comptés, et re-plaqué dans les flacons T75 Bind cellulaire pour augmenter leur nombre. Flacons T75 ensemencé avec 2-3 millions de cellules grandissent à 80% de confluence dans les 4 semaines. Élargi primaires des cellules épithéliales humaines peuvent être cultivées et autorisés à différencier sur l'interface air-liquide. Les méthodes décrites ici fournissent une source abondante de cellules épithéliales bronchiques humaines provenant de tissus fraîchement isolées et permettent d'étudier ces cellules comme des modèles de la maladie et pour la pharmacologie et des examens toxicologiques.
Protocol
Discussion
Dans cette étude, nous avons présenté des méthodes détaillées pour la culture et l'expansion de l'enseignement primaire cellules épithéliales bronchiques humaines. Nous avons démontré comment des explants et des greffes de tissu bronchique, cultivées dans un milieu qui favorise la croissance des cellules épithéliales, peut fournir une source continue de cellules des voies respiratoires épithéliales humaines pour les études de non-différenciées des modèles cellulaires (immergée) et différenci…
Acknowledgements
Les auteurs sont très reconnaissants au Dr Richard Inculet pour fournir les tissus bronchiques. Éthique de la recherche approbations du Conseil ont été obtenus à partir de Saint-Joseph de Hamilton et l'Université de Western Ontario / London Health Sciences Centre (Dr. David McCormack), les tissus et les Archives du Comité, Département de pathologie. Nous remercions également Ernie Spitzer (microscopie électronique, Université McMaster) pour fournir TEMs de nos cultures ALI, et Farkas Daniela pour fournir une partie des matériaux nécessaires à la immunomarquage. Ce travail a été financé par une subvention terme Bloquer l'Ontario Thoracic Society, le Dr Asma Yaghi a été soutenue par une bourse FSORC, soins de santé St-Joseph de Hamilton, Ontario, Canada.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Albumin from bovine serum, powder | Sigma | A4919 | Use for coating solution | |
| COLLAGEN TYPE I 0.1% Solution Sterile-filtered | Sigma | C8919 | Use for coating solution | |
| Fibronectin from human plasma | Sigma | F2006 | Use for coating solution | |
| Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS, sterile) | Sigma | 28888 | Use for rinsing tissue and for coating solution | |
| DMEM/Ham F-12 | Sigma | D8437 | ||
| FBS | Sigma | F1015 | Inactivate, then aliquot and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Antibiotic-Antimycotic Stabilized | Sigma | A5955 | Aliquot into 2 ml vials and freeze (-20°C); use fresh when needed | |
| Albumin solution from bovine serum | Sigma | A8412 | BSA | |
| Pituitary Extract Bovine | Sigma | P1476 | BPE | |
| Epidermal growth factor | Sigma | E9644 | EGF | |
| (±)-Epinephrine | Sigma | E1635 | ||
| Insulin | Sigma | I6634 | ||
| Tranferrin Human | Sigma | T8158 | ||
| Triiodo-L-thyronine | Sigma | T6397 | ||
| Hydorcortisone | Sigma | H0888 | ||
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | ||
| Trypsin | Sigma | T9935 | ||
| EDTA | Sigma | E6758 | EDTA | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P5368 | PBS | |
| 70% ethanol | Use for disinfecting and cleaning | |||
| 24 well Transwells | Corning | 3470 | ||
| Cell Culture Flasks (T75) CLLBND from Corning | Fisher Scientific | 05-539-104 | These flasks have a Cell Bind coating which promotes cell attachment and growth | |
| Monoclonal Anti-Cytokeratin, pan-FITC antibody | Sigma | F3418 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:250 dilution | |
| Antibody: E-Cadherin (H108) | Santa Cruz | sc-7870 | Do not permeabilize; Use 1:250 dilution and A21207 (Invitrogen) as secondary antibody | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21207 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: Monoclonal mouse Anti- α-Smooth Muscle Actin-Cy3 | Sigma- Aldrich | C6198 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution | |
| Antibody: Vimentin (RV202) | Santa Cruz | Sc-32322 | Permeabilization: 0.2% TRITON X-100/PBS; Use 1:100 dilution and T2402 (Sigma- Aldrich) as secondary antibody | |
| Rabbit anti-mouse TRITC | Sigma- Aldrich | T2402 | Use 1:400 dilution | |
| Antibody: CD31 or PECAM-1 (M-20) | Santa-Cruz | Sc-1506 | Do not permeabilize; Use 1:200 dilution and Donkey anti-goat IgG-FITC as secondary antibody | |
| Donkey anti-goat IgG-FITC | Santa-Cruz | Use 1:100 dilution | ||
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Refrigerate in the dark; stains nuclei and retains fluorescence during prolonged storage | |
| Vectashield Mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | Refrigerate in the dark; retains fluorescence during prolonged storage | |
| Hoechst Stain solution | Sigma | H6024 | Stains nuclei; use 1:10 dilution and Vectashield H-1000 |
Other requirements: incubator, biological safety cabinet (BSC), centrifuge, 100mm culture plates, sterile tubes (15 ml, 50 ml, and 2 ml), sterile pipette tips, scalpel handle and blades, small sharp scissors, lab coats and gloves. These can be obtained from your preferred suppliers.
References
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