Floral-dip Transformação de Arabidopsis thaliana Examine a PTSO2:: β-glucuronidase Expressão Gênica Reporter
Summary
Este artigo ilustra o floral-dip método de<em> Agrobacterium tumefaciens</em> Mediada por transformação de<em> Arabidopsis thaliana</em>. Pela introdução de um ciclo celular regulados promotor-repórter,<em> PTSO2:: β-glucuronidase (GUS)</em>, Em<em> Arabidopsis</em>, Que ilustra como um detecta GUS expressão repórter em mudas transgênicas.
Abstract
A capacidade de introduzir genes estranhos em um organismo é a base para a biologia moderna e biotecnologia. Na planta de floração modelo<em> Arabidopsis thaliana</em>, O floral-dip método de transformação<sup> 02/01</sup> Substituiu todos os métodos anteriores devido à sua simplicidade, eficiência e baixo custo. Especificamente, brotos de flores jovens<em> Arabidopsis</emPlantas> são mergulhados em uma solução de<em> Agrobacterium tumefaciens</em> Carregando construções específicas de plasmídeo. Após imersão, as plantas são devolvidos para o crescimento normal e sementes de rendimento, uma pequena porcentagem dos quais são transformados com o gene estranho e pode ser selecionado para em meio contendo antibióticos. Este método floral-dip significativamente facilitado<em> Arabidopsis</em> Pesquisa e contribuíram muito para nossa compreensão da função dos genes da planta. Neste estudo, usamos o floral-dip método para transformar um gene repórter,<em> Β-glucuronidase (GUS)</em>, Sob o controle de<em> TSO2</em> Promotor.<em> TSO2</em>, Codificação para a ribonucleotídeo redutase (RNR) subunidade pequena<sup> 3</sup>, É um gene do ciclo celular regulados essencial para a biossíntese dNDP na fase S do ciclo celular. Exame de<em> GUS</em> Expressão em transgênicos<em> Arabidopsis</em> Mudas mostra que<em> TSO2</em> É expressa em divisão ativa tecidos. O método relatado experimental e materiais podem ser facilmente adaptadas não só para a investigação, mas também para a educação na escola e na faculdade.
Protocol
Discussion
A eficiência de transformação é determinada por muitos fatores diferentes, que são discutidos abaixo:
- A saúde das plantas e sua idade é de importância primordial. Cerca de um mês de idade plantas produzindo inúmeros botões florais imaturos são ideais. Aparando os galhos primária para encorajar a formação secundária dia 04/03 tiro antes da transformação irá aumentar a eficiência de transformação. Plantas mais velhas dará origem a transformantes, mas a uma taxa inferior.
- Ferti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Chunxin Wang para a construção de pTSO2:: GUS e para fotos na Figura 1, Detlef Weigel para compartilhar o protocolo GUS-infalível, Paja Sijacic, e Courtney Hollender para comentários úteis. Pesquisa em laboratório Z. L s é apoiado pela National Science Foundation EUA (IOB0616096 e MCB0744752). ZL é parcialmente financiado pela Universidade de Maryland Estação Experimental Agrícola.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 6-benzyladenine | Sigma | 852430 | ||
| Silwet-77 | Crompton Corp. | Toxic, wear gloves | ||
| Murashige and Skoog Basal medium (MS) | Sigma | M5519 | ||
| Gamborg’s vitamin solution 1000X | Sigma | G1019 | ||
| X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide cyclohexamine salt | Biosynth | B-7300 | Toxic, light sensitive keep in the dark | |
| Micropore 3M Tape | Fisher | 19027761 |
References
- Clough, S. J. Floral dip: agrobacterium-mediated germ line transformation. Methods Mol Biol. 286, 91-91 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-735 (1998).
- Wang, C., Liu, Z. Arabidopsis ribonucleotide reductases are critical for cell cycle progression, DNA damage repair, and plant development. Plant Cell. 18 (2), 350-350 (2006).
