Summary
In diesem Artikel wird ein optimiertes Protokoll für die Etablierung eines Pulpitis-Modells bei Mäusen unter Verwendung eines innovativen Mundknebels vorgestellt, gefolgt von einer anschließenden histologischen Analyse.
Abstract
Pulpitis, eine häufige Ursache für natürlichen Zahnverlust, führt zu Nekrose und Verlust der Bioaktivität in der entzündeten Zahnpulpa. Die Aufklärung der Mechanismen, die der Pulpitis zugrunde liegen, und ihre effiziente Behandlung ist ein ständiger Schwerpunkt der endodontischen Forschung. Daher ist das Verständnis des Entzündungsprozesses in der Zahnpulpa für die Verbesserung der Pulpakonservierung von entscheidender Bedeutung. Im Vergleich zu anderen In-vitro-Experimenten bietet ein murines Pulpitis-Modell einen authentischeren und genetisch vielfältigeren Kontext, um das pathologische Fortschreiten der Pulpitis zu beobachten. Die Verwendung von Mäusen stellt jedoch trotz ihrer Kosteneffizienz und Zugänglichkeit aufgrund ihrer geringen Größe, schlechten Koordination und geringen Verträglichkeit Schwierigkeiten dar, was intraorale und zahnärztliche Eingriffe erschwert. Dieses Protokoll führt ein neuartiges Design und die Anwendung eines Mundknebels ein, um die Pulpa von Mäusen freizulegen und so effizientere intraorale Verfahren zu ermöglichen. Der Mundknebel, der aus einem Zahnbogen besteht, ist den meisten Zahnärzten leicht zugänglich und kann die chirurgische Vorbereitung erheblich beschleunigen, selbst bei erstmaligen Eingriffen. Mikro-CT, Hämatoxylin-Eosin (HE)-Färbung und Immunfluoreszenz-Färbung wurden verwendet, um Veränderungen in der Morphologie und Zellexpression zu identifizieren. Das Ziel dieses Artikels ist es, Forschern dabei zu helfen, ein reproduzierbareres und weniger anspruchsvolles Verfahren zur Erstellung eines Pulpaentzündungsmodells mit diesem neuartigen Mundknebel zu etablieren.
Introduction
Die Zahnpulpa, ein integraler Bestandteil des Zahns, ist für mehrere wesentliche Funktionen wie Nährstoffversorgung, Dentinbildung, sensorische Funktion und Abwehrreaktionen verantwortlich1. Dennoch ist die von Hartgewebe umgebene Zahnpulpa anfällig für Verletzungen und Schäden durch tiefe Karies, Pulpitis, Trauma oder Folgetherapien 2,3. Das Fehlen von funktioneller Zahnpulpa erhöht das Risiko einer Zahnbrüchigkeit4. Darüber hinaus kann der Verlust der Vitalität der Pulpa bei jungen bleibenden Zähnen die Zahnreifung negativ beeinflussen, und die derzeitigen Prothesentechniken können das neuronale Feedback, das eine gesunde Pulpa bietet, nicht wiederherstellen4. Diese Situation hat Forscher dazu veranlasst, alternative Lösungen für den Umgang mit entzündeter Pulpa zu erforschen, die über die bloße Entfernung hinausgehen.
Im Jahr 2007 initiierten Murray et al. die Anwendung von Tissue Engineering in der regenerativen Endodontie und weckten damit ein erhöhtes Interesse an der Erhaltung und Regeneration der Pulpa5. Entzündetes Pulpagewebe stellt jedoch eine Herausforderung dar, da die Zellen Entzündungsfaktoren wie IL-6 freisetzen, die Entzündungszellen rekrutieren und zu Zellnekrose, Verlust der Pulpavitalität und Komplikationen bei der funktionellen Wiederherstellung führen 6,7. Das Verständnis von Entzündungen und dem damit verbundenen Zelltod ist daher entscheidend für Fortschritte bei der Konservierung vitaler Pulpa. Es gibt eine Reihe von Experimenten, die durchgeführt wurden, um die Molekularbiologie der entzündeten Pulpa in vivo oder in vitro zu erforschen 8,9. Obwohl In-vitro-Experimente wie 2D- oder 3D-Zellkulturen seit Jahren entwickelt werden und ausgereift sind und weit verbreitet sind, um Reaktionen von Pulpazellen auf Entzündungsfaktoren zu testen, können diese Experimente die Interaktion zwischen Pulpagewebe und dem systemischen Immunsystem nicht widerspiegeln10. Wenn das untersuchte Phänomen aus Zellen anderer Gewebeherkunft wie Immun-, Gefäß- und Nervensystem stammt, führt die reine Zellkultur in eine Sackgasse. Daher sind In-vivo-Experimente sehr notwendig und referenziell.
Mäuse sind aufgrund ihrer Kosteneffizienz, hohen Fruchtbarkeit und Vitalität zunehmend zu einer häufigen Wahl in der Entzündungsforschung in vivo geworden. Ein umfassendes Protokoll für das Pulpitis-Modell von Mäusen gibt es derzeit jedoch nicht, das als Referenz dienen kann. Die geringe Größe der Mäuse und ihre Empfindlichkeit gegenüber Stimulation stellen eine große Herausforderung bei den experimentellen Verfahren dar. Die Beobachtung der winzigen Zähne, die tief im Mund der Maus verborgen sind, erfordert oft den Einsatz eines Auslegermikroskops, ungeachtet der häufigeren Präsenz von Tischmikroskopen in Laboratorien. Das Fehlen eines Mundöffners erfordert die Hilfe anderer. Um dies zu beheben, hat die Gruppe einen Mundknebel aus leicht verfügbaren Materialien entwickelt, der ein standardisiertes und reproduzierbares Protokoll für die Konstruktion des Pulpitis-Modells von Mäusen bereitstellen soll. In diesem Artikel wird das Verfahren detailliert beschrieben, das die präoperative Vorbereitung, die Immobilisierung, die Pulpafreilegungsoperation und die Probenentnahme an C57-Mäusen umfasst. Dieses Protokoll empfiehlt die Verwendung des Mundknebels und liefert Informationen über seine Struktur, Herstellung und Anwendung, um anderen Forschern die Replikation des Verfahrens zu erleichtern.
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Protocol
Die experimentellen Verfahren in dieser Studie wurden von der Ethikkommission der West China School of Stomatology der Universität Sichuan genehmigt (WCHSIRB-D-2021-125). Adulte C57BL/6-Mäuse wurden von der Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China, gewonnen. Die gesamte Krone des ersten Backenzahns des Oberkiefers bricht 21 Tage nach der Geburt durch. Mäuse für die Operation sollten älter als 21 Tage sein und eine normale Vitalitätaufweisen 11. Hier wurden 6 bis 8 Wochen alte Mäuse für die Modellierung verwendet. Abbildung 1 ist ein Flussdiagramm, das das verwendete Protokoll zeigt.
1. Präoperative Vorbereitung (Abbildung 2)
- Besorgen Sie sich folgende Instrumente: Stereoskopisches Mikroskop, Fixierplatte, medizinisches Klebeband, Mundknebel, minimalinvasiver Zahnfräser mit einem Durchmesser von 0,6 mm, zahnärztliches Hochgeschwindigkeits-Zahnhandstück, 8# C+ Feile, Heizkissen, 1 mL Spritze, steriler Wattebausch, Augenzange.
- Besorgen Sie sich die folgenden Medikamente: Anästhesiemischung, Veterinärsalbe.
2. Vorbereitung des Mundknebels
- Wiegen und betäuben Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion einer Anästhesie-Mix-Lösung (10 % Ketaminhydrochlorid + 5 % Xylazin + 85 % sterile isotonische Kochsalzlösung) bei 0,007 ml/g Körpergewicht und bestätigen Sie die ordnungsgemäße Anästhesie durch die Zehenkneifmethode. Tragen Sie eine Augenschmiersalbe auf die Augen auf, um Augenverletzungen durch Austrocknung während der Operation zu vermeiden.
HINWEIS: Medizinische Hüte, Masken, Handschuhe und Overalls sowie andere grundlegende Schutzmaßnahmen sind erforderlich. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Operationsumgebung als auch die Mauskammer sauber und sicher sind. Ein Wärmekissen zur thermischen Unterstützung während des gesamten Eingriffs ist erforderlich. - Bereiten Sie den Mundknebel wie unten beschrieben vor (Abbildung 3).
- Beziehen Sie folgende Materialien: Kieferorthopädischer Bogendraht mit einem Durchmesser von 8 μm, eine junge Schlaufenbiegezange, ein schwerer Drahtschneider, ein Markierungsstift, eine Gummikappe mit einer Länge von 3 mm und einem Querschnittsdurchmesser von 1 mm.
- Zuerst richten Sie den Bogendraht mit der linken Hand zur Fixierung aus und Daumen, Zeigefinger der rechten Hand beugen sich leicht gegen den Drahtbogen. Wiederholen Sie diese Aktion mehrmals, um das Biegen auf den richtigen dreidimensionalen Winkel zu erleichtern.
- Biegen Sie mit der Yong-Schlaufenbiegezange die Oberkante (Bild 3G, a-i) des Trapezes (Bild 3C, a-l-k-b) etwa 8 mm lang in der Mitte des Bugdrahtes. Stellen Sie sicher, dass sich Punkt a (Abbildung 3) am Rand des Zangeschnabels befindet.
- Halten Sie die Zange mit der linken Hand fest, klemmen Sie mit dem rechten Daumen und Zeigefinger das freie Ende des Bügeldrahtes fest und biegen Sie den Bügeldraht von Punkt a aus in einen Winkel von etwa 120°. Duplizieren Sie die vorherige Aktion bei Punkt i (Abbildung 3G). Überprüfen Sie, ob sich der Bogen auf einer Ebene befindet, indem Sie ihn ohne Aufhebeln auf einen horizontalen Tisch legen.
- Lassen Sie auf jeder Seite etwa 9 mm Länge (Abbildung 3D, a-b, l-k) und biegen Sie das freie Ende in einen 75°-Winkel, indem Sie die gleiche Vorgehensweise wie in Schritt 2.2.4 anwenden, wobei Sie darauf achten, dass sich jede Kante auf einer Ebene befindet. Biege diesen spitzen Winkel mit der Spitze des Zangeschnabels.
- Finde den Punkt c etwa 5 mm von Punkt b entfernt. Befolgen Sie die gleiche Fähigkeit, um einen 105°-Winkel auf Punkt c zu biegen. Biegen Sie einen weiteren 105°-Winkel an Punkt d 5 mm von Punkt c entfernt. Lassen Sie etwa 4,5 mm von Punkt d entfernt und suchen Sie Punkt e. Biegen Sie das freie Ende an Punkt e so, dass es einen Winkel von etwa 100 -105° bildet (Abbildung 3E).
HINWEIS: Die 6-8 Wochen alten C57-Mäuse, die wir verwendet haben, wogen etwa 20 g. Der Abstand von 5 mm könnte nicht nur den Ober- und Unterkiefer der Mäuse einklemmen, ohne sich zu bewegen, sondern würde auch nicht auf die Haut der Mäuse drücken und Beschwerden verursachen. Wenn andere Arten oder Alter von Mäusen verwendet werden, passen Sie bitte die Länge der c-d- und i-h-Teile an die tatsächliche Situation an (Abbildung 3E, G). - Beugen Sie einen zusätzlichen Zungenspatel für den Unterkieferteil (Abbildung 3G, j-i-h-g).
- Doppelte Biegeschritte des a-b-c-Teils auf dem l-k-j-Teil. Klemmen Sie i-k- und k-j-Teile gleichzeitig und biegen Sie das freie Ende an Punkt j, um es senkrecht zur i-k-j-Ebene zu machen. Klemmpunkt i, der 5 mm von Punkt j entfernt ist, biegen Sie das freie Ende so, dass es sowohl zur i-k-j-Ebene als auch zum c-d-Teil parallel ist (Abbildung 3H).
- Lassen Sie 5 mm Länge von Punkt i, biegen Sie den Bogen an Punkt h vertikal zum i-h-Teil und parallel zur j-i-h-Ebene. Ermitteln Sie Punkt g bei 5 mm von Punkt h. Klemmen Sie die Ebene j-i-h-g und biegen Sie das freie Ende symmetrisch zum k-j-Teil. Dann sollte das freie Ende nach dem Punkt f symmetrisch zum freien Ende des Punktes e sein (Abbildung 3H).
- Setzen Sie Gummikappen auf das freie Ende (Abbildung 3F).
3. Immobilisierung
- Fixieren Sie die Maus in Rückenlage auf der Fixierplatte, wobei die Gliedmaßen mit Hautband gesichert sind. Die freien Enden des Mundknebels mit Daumen und Zeigefinger zusammendrücken.
- Fixieren Sie die vorderen Schneidezähne der Maus in der trapezförmigen Rille von zwei Armen. Stellen Sie sicher, dass der Arm mit dem Zungenspatel für den Unterkiefer bestimmt ist. Passen Sie den Mundknebel an, um sicherzustellen, dass die Zunge der Maus immobilisiert, aber nicht ischämisch ist.
4. Beurteilung der Zähne
- Stellen Sie sicher, dass der erste Backenzahn des Oberkiefers für die Operation frei von Karies, Traumata und Odontogenese ist. Stellen Sie sicher, dass sich keine Rötungen, Schwellungen oder Fisteln auf der umgebenden Gingiva befinden. Stellen Sie sicher, dass die gegenüberliegenden Zähne gesund sind und als gesunde Kontrollgruppe zur Verfügung stehen.
5. Exposition der Pulpa
- Bohren Sie mit Zahnfräser an der okklusalen Seite des ersten Molaren des Oberkiefers mit einer Drehzahl von 20.000 U/min. Stellen Sie sicher, dass der Zahnschmelz entfernt wird. Halten Sie die Operation mit dem zahnärztlichen Handstück nur in einer flachen Dentinschicht, um eine übermäßige thermische Stimulation des Zahnpulpagewebeszu vermeiden 12.
- Verhindern Sie gleichzeitig eine Überhitzung, indem Sie während der Operation alle 3 Minuten mit einer Spritze normale Kochsalzlösung auf den Zahn tropfen.
- Legen Sie eine 8# oder 10# C+ Feile auf die unterste Position der Bohrgrube und stechen Sie durch das letzte Dentin, um die Pulpakammer freizulegen. Es wird ein offensichtliches Sturzgefühl sein, wenn das lokale Dentin gründlich entfernt wird. Nicht zu tief bohren, da sonst Zahnpulpagewebe aus der Pulpakammer herausgeholt werden könnte.
- Reinigen Sie die Fragmente um den Zahn herum. Nehmen Sie den Mundknebel ab; Die Operation ist abgeschlossen. Verwenden Sie den gegenüberliegenden ersten Molaren des Oberkiefers als Kontrolle ohne Operation.
6. Nachsorge
- Verabreichen Sie nach der Operation Carprofen (5 mg/kg) subkutan und legen Sie die Maus bis zur Genesung aus der Narkose in Bauchlage auf das chemothermische Heizkissen. Füttern Sie die Mäuse und stellen Sie Trinkwasser zur Verfügung. Der Wiederherstellungsprozess sollte überwacht werden. Keine anderen Tiere sollten sich in derselben Kammer befinden, bis sich die Maus vollständig erholt hat.
7. Probenentnahme und -lagerung
- Euthanasieren Sie die Maus mit zervikaler Luxation unter tiefer Betäubung 24 Stunden nach der Operation oder zu einem anderen Zeitpunkt gemäß Experiment9. Schneiden Sie die Skelettmuskulatur, die am Oberkiefer und am Jochbein befestigt ist, mit einer Augenschere durch. Skelett, Stirnbein und Weichgewebe entfernen und die Lamina gnathostegit mit den Oberkiefermolaren herausnehmen.
HINWEIS: Laut He et al. wird empfohlen, dass die Pulpitis-Probe weniger als 72 Stunden nach der Operation entnommen werden sollte, um eine ausgedehnte Nekrose im Zahnpulpagewebe zu vermeiden13. - Teilen Sie das Gnathostegit sagittal in zwei Hälften und lagern Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd in PBS, pH 7,4, bei 4 °C für die 24h-Fixierung.
8. Histologische Analyse
- Waschen Sie das Gewebe mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entkalken Sie es in täglich gewechselter Entkalkungslösung von 5 % EDTA und 4 % Saccharose in PBS, pH 7,4, bei 4 °C für 2-4 Wochen10.
- Betten Sie den 1/2 Gnathostegit in Paraffin ein und stellen Sie sicher, dass sich das sagittale Gesicht ohne Zähne am unteren Rand der Gewebekassetten befindet.
- Schneiden Sie den Paraffinblock mit einem Paraffinmikrotom in 5 μm dicke Scheiben. Passen Sie den Winkel des Paraffinblocks entsprechend der unter dem Mikroskop beobachteten proximalen, distalen, oberen und unteren Beziehung an, um sicherzustellen, dass die gesamte Kronenpulpa und die Perforation des ersten Molaren durchtrennt werden können.
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Representative Results
Das oben beschriebene Verfahren wurde an den ersten Molaren des rechten Oberkiefers von 3 6-8 Wochen alten C57BL/6-Mäusen durchgeführt, während die ersten Molaren des linken Oberkiefers als Kontrolle erhalten blieben. Zur Demonstration wurden histologische und immunfluoreszierende Ergebnisse der Blindkontrolle, 12-stündige Pulpitis- und 24-stündige Pulpitis-Proben verwendet.
Nach dem Protokoll der CT-Analyse von Goldman et al.15 wurde die Exposition der Pulpa durch Mikro-CT und Rekonstruktionsmodellierung in Abbildung 4 A-C bestätigt. Sagittale Schnitte der ersten Molaren des Oberkiefers, sowohl von der Kontroll- als auch von der Operationsseite, wurden einer HE-Färbung unterzogen (Abbildung 5). Es wurden Nekrosen des Pulpagewebes und der Zerfall der Zellmorphologie am Wundrand gezeigt. Die Nekrose konzentrierte sich hauptsächlich im Pulpagewebe in der Nähe der Perforation, und die Form des Pulpagewebes auf der ungeöffneten Seite war normal. Nach 24 h war der größte Teil des Pulpagewebes, einschließlich der Wurzelpulpa, morphologisch intakt. (Abbildung 5).
Die Expression von IL-614 war in der Kontrolle gering, und eine kleine Menge IL-6 konnte um die Wunde nach 12 Stunden beobachtet werden, während die Expression von IL-6 nach 24 Stunden signifikant erhöht war. Darüber hinaus konzentrierte sich die Expression von IL-6 hauptsächlich auf den Wundrand und das mittlere Pulpahorn (Abbildung 6). In Abbildung 6 D,E nimmt die Anzahl der IL-6+ Zahnpulpazellen und das Verhältnis der IL-6+ Zellen zur Gesamtzahl der Zahnpulpazellen im Laufe der Zeit in drei Zeitpunkten zu. Es kann davon ausgegangen werden, dass der Bereich nach Exposition der Pulpa allmählich eine Entzündung entwickelt und sich verschlimmert.
Wir haben 5 Kollegen, die noch nie eine Operation an Oberkieferzähnen von C57-Mäusen durchgeführt haben, eingeladen, ihre Zeit zu berechnen, die benötigt wird, um den Ober- und Unterkiefer einer Maus zu immobilisieren (Stadium 1) und den ersten Backenzahn der Maus im Oberkiefer (Stadium 2) nach dem traditionellen Verfahren mit zwei Gummibändern freizulegen, das sich auf das von Goldman et al. veröffentlichte Protokoll oder unser Protokoll mit dem Mundknebelbezieht 15. Für die Analyse wurde auch die Zeit für die korrekte Platzierung des Bohrers auf dem ersten Backenzahn des Oberkiefers der Maus unter dem Mikroskop berechnet. Die Ergebnisse in Abbildung 3 J,K deuten darauf hin, dass die Zeit der Mundfixation und des Auffindens des ersten Molaren der Maus im Oberkiefer mit dem Mundknebel im Vergleich zur herkömmlichen Methode signifikant verkürzt war (P<0,05). Die Verwendung eines Mundknebels kann die Betriebseffizienz verbessern und die Operationsschwierigkeiten verringern.
Abbildung 1: Flussdiagramm des Verfahrens zur Belichtung der Pulpa. (A) Nach der Fixierung mit Mundknebel sollte der erste Molaren des Oberkiefers der Maus unter dem Mikroskop vollständig freigelegt werden. (B) Verwenden Sie ein zahnärztliches Hochgeschwindigkeitshandstück mit minimalinvasivem Zahngrat, um den okklusalen Zahnschmelz und das oberflächliche Dentin des ersten Backenzahns zu entfernen, aber achten Sie darauf, das Dentin nicht direkt zu durchdringen, um einen übermäßigen Einfluss auf die Pulpa durch Überhitzung zu vermeiden. (C) Verwenden Sie eine 8# C+ Feile, um in das verbleibende Dentin einzudringen und die Pulpa freizulegen. (D) Die Proben wurden 24 Stunden nach der Operation entnommen. HE- und Immunfluoreszenzfärbung zeigten, dass zu diesem Zeitpunkt ein Pulpitis-Modell etabliert werden konnte. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Ausrüstung für das Pulpa-Belichtungsverfahren. (A) Stereoskopisches Mikroskop und Motor des dentalen Hochgeschwindigkeits-Dentalhandstücks. (B) Die 8# C+-Feile, ein minimalinvasiver Zahnfräser, ein Mundknebel, eine Pinzette und ein zahnärztliches Hochgeschwindigkeits-Zahnhandstück. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Herstellung des Mundknebels. (A) Biegen Sie den Draht, um zwei funktionierende Arme des Mundknebels herzustellen. (B-C) Schritte zum Biegen des Zungenspatels für den Unterkiefer. (D-E) Kein Zungenspatel für den Oberkiefer. (F, H) Gummikappen oder gebogene Enden werden benötigt, um Verletzungen vor Stichen zu schützen. (G) Drei Ansichten des Mundknebels als Referenz. (I) Klinische Anwendung des Mundknebels. (J) Die durchschnittliche Zeit für Anfänger, um den Ober- und Unterkiefer (Stufe 1) mit der traditionellen Fixationsmethode bzw. dem Mundknebel zu fixieren. (K) Die durchschnittliche Zeit für Anfänger, um den ersten Molaren des Oberkiefers (Stadium 2) mit der traditionellen Fixationsmethode bzw. dem Mundknebel eindeutig zu finden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Mikro-CT-Analyse eines operierten Faustmolaren mit Perforation, die durch eine rot gestrichelte Linie markiert ist. (A) Sagittale Zahnebene, stellen Sie sicher, dass keine Perforation auf dem Boden der Pulpakammer vorhanden ist. (B) Koronale Ebene. Entsprechend der Perforation in (A) ist eine vollständige Durchdringung des mit einer rot gestrichelten Linie eingekreisten Schmelzdentins zu beobachten. (C) Okklusionsebene des CT-Rekonstruktionsmodells. Die Position der Perforation, die mit einer rot gestrichelten Linie eingekreist ist, wird auf intuitivere Weise bestätigt und der Boden der Zellstoffkammer kann durch Perforation beobachtet werden. (D-G) Intraoperative Fotos der Behandlung. (D) Überprüfen Sie den ersten Backenzahn des Oberkiefers der Maus, um sicherzustellen, dass keine Karies oder Fehlbildungen vorhanden sind. (E) Verwendung eines minimalinvasiven Fräsers zur Entfernung von Zahnschmelz und flachem Dentin. Wie auf dem Bild zu sehen ist, ist auf der Kaufläche des Zahnes eine Grube (eingekreist mit einer gestrichelten weißen Linie) ohne Perforation zu sehen. (F) Mit einer 8# C+ Feile, um in das verbleibende Dentin einzudringen, kann die Feile ohne Handstütze im Zahn stecken bleiben. (G) Wenn die Feile entfernt wird, weist der Zahn eine rosa Perforation auf, was auf eine erfolgreiche Freilegung der Pulpa hinweist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Hämatoxylin-Eosin-Färbung. (A) Ganzheitliche Betrachtung des unbehandelten ersten Molaren zur Kontrolle. (A-1,2,3) Hohe Vergrößerungszahlen entsprechen 1, 2, 3 im Feld (A). Die Form des Zahnpulpagewebes an 3 Positionen war intakt und die Odontoblasten waren in geordneter Anordnung. (B) Ganzheitliche Betrachtung der Zähne 12 Stunden nach der Operation. (B-1,2,3) Hohe Vergrößerungszahlen entsprechen 1, 2, 3 im Panel (B). Die Form des Zahnpulpagewebes an Position 1 und 2 war im Allgemeinen intakt. In der Nähe der Perforation konnte eine Nekrose beobachtet werden. (C) Ganzheitliche Betrachtung der Zähne 24 Stunden nach der Operation. (C-1,2,3) Hohe Vergrößerungszahlen entsprechen 1, 2, 3 im Feld (C). Die Nekrose erstreckt sich von einem einzelnen Pulpahorn bis zum nahe gelegenen Pulpagewebe. Aber die meisten Pulpagewebe, einschließlich der Wurzelpulpa, sind morphologisch intakt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Immunfluoreszenz-Färbung. (A) Ganzheitliche Betrachtung des unbehandelten ersten Molaren zur Kontrolle. (A-1,2,3) Hohe Vergrößerungszahlen entsprechen 1, 2, 3 im Feld (A). Es konnte nahezu keine Expression von IL-6 beobachtet werden. (B) Ganzheitliche Betrachtung der Zähne 12 Stunden nach der Operation. (B-1, 2, 3) Hohe Vergrößerungszahlen entsprechen 1, 2, 3 im Panel (B). Erhöhung des IL-6, das in Gewebe in der Nähe der in B-3 gezeigten Perforation konzentriert ist. Bei B-1,2 wurden keine offensichtlichen Veränderungen beobachtet. (C) Ganzheitliche Betrachtung der Zähne 24 Stunden nach der Operation. (C-1, 2, 3) Hohe Vergrößerungszahlen entsprechen 1, 2, 3 im Feld (C). Die Expression von IL-6 war in C-2,3 signifikant erhöht. (D) Gesamtmenge der IL-6+ -Zahnpulpazellen in der Kontrolle, 12 h Pulpa-Exposition, 24 h Pulpa-Exposition Immunfluoreszenz-Färbeergebnisse. (E) Verhältnis der IL-6+-Zellen zur Gesamtmenge der Zahnpulpazellen in der Kontrolle, 12 h Pulpa-Exposition, 24 h Pulpa-Exposition Immunfluoreszenz-Färbeergebnisse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Als einzelnes Weichgewebe in den Zähnen spielt die Zahnpulpa eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Bioaktivität des Zahns, bleibt aber hochempfindlich. Die Erhaltung dieser lebenswichtigen Pulpa hat sich in den letzten endodontischen Behandlungen zum bevorzugten Ansatz entwickelt, was ein umfassendes Verständnis der Entzündungsmechanismen der Zahnpulpa erforderlich macht16. Die räumlich-zeitliche Fluktuation der inflammatorischen Mikroumgebung und die Wechselwirkungen zwischen residenten Zelltypen bei der Pulpitis erschweren die Untersuchung durch in vitro-Studien 11. Stattdessen bieten In-vivo-Studien Vorteile, indem sie die physiologische Umgebung des Menschen nachahmen. Die Verwendung von experimentellen Mäusen, insbesondere solchen mit überexprimierten oder ausgeschalteten Genen, stellt ein effektives Instrument zur Hypothesenvalidierung dar. Die in Laboratorien häufig verwendeten C57-Mäuse stellen jedoch aufgrund ihrer geringen Größe und mangelnden Koordination eine Herausforderung dar, was die Anwendung von Reizen auf ihre Zähne problematisch macht17. Um dieses Problem anzugehen, ist eine umfassende Erklärung des neuartigen Mundknebels erforderlich, um Forscher bei der Durchführung von Eingriffen in der Mundhöhle von Mäusen zu unterstützen. Darüber hinaus skizziert dieser Artikel das Protokoll zur Etablierung eines Pulpitis-Modells durch Pulpa-Exposition am ersten Backenzahn der Maus unter Verwendung des Mundknebels und bietet damit einen wertvollen Leitfaden für die nachfolgende Forschung.
Nach zahlreichen Iterationen wurde erfolgreich ein skalierbarer Mundknebel entwickelt, der einfach zu konstruieren ist. Die Abmessungen und ein Drei-Ansichten-Schema des Mundknebels sind in Abbildung 3 dargestellt. Das Protokoll vereinfachte den Drahtbiegeprozess erheblich, indem es ein trapezförmiges Design anstelle eines Lichtbogens verwendete. Der Mundknebel besteht aus einem kieferorthopädischen Drahtbogen mit einem Durchmesser von 0,8 mm, der das Verrutschen aus dem Mund der Maus ausgleicht und eine ausreichende Öffnungskraft bietet. Darüber hinaus schützt die Elastizität des kieferorthopädischen Bogens das Kiefergelenk der Mäuse. Der Mundknebel ist kompakt, korrosionsbeständig und kann in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit Alkohol für den wiederholten Gebrauch aufbewahrt werden. Trotz des Beißdrucks einer Maus bleibt der Mundknebel stabil im Mund, so dass die Forscher ohne fremde Hilfe unter dem Mikroskop operieren können. Es ist zu beachten, dass die Größe des Mundknebels an verschiedene Körpergrößen der Maus angepasst werden kann. Wenn der Mund über die Grenze der Maus hinaus gedehnt wird, sollte der Mundknebel sofort entfernt werden, um Verletzungen des Kiefergelenks (CMD) oder der Kiefer- und Gesichtsmuskulatur zu vermeiden.
Der Bericht von He et al. zeigt, dass eine Nekrose 24 h nach der Pulpaexposition nachgewiesen werden kann, wobei der Großteil des Pulpagewebes nach 72 h18 nekrotisch wird. Daher ist es wichtig, das Pulpagewebe innerhalb dieses 72-Stunden-Fensters zu sammeln, um ungültige experimentelle Schlussfolgerungen aufgrund von übermäßig abgestorbenen Zellen zu vermeiden. Beim Einführen der C+-Feile in die Pulpakammer muss wiederholtes Drehen und tiefes Drücken vermieden werden, um eine übermäßige Schädigung des Pulpagewebes zu vermeiden. Wenn während des Eingriffs starke Blutungen auftreten, wird empfohlen, das Blut vorsichtig mit einem kleinen Wattebausch zu entfernen, um Husten zu vermeiden. Die Operation sollte nur auf einer Seite des Oberkiefers der Maus durchgeführt werden, da die gleichzeitige Modellierung auf beiden Seiten möglicherweise negative Auswirkungen auf die Modellgenauigkeit hat, was zu Komplikationen bei der Nahrungsaufnahme führen kann. Nach der Operation wird empfohlen, den Mäusen keine entzündungshemmenden Medikamente oder Antibiotika zu verabreichen.
Der Mundknebel ist zwar wirksam, um das Maul der Maus offen zu halten, hat aber Einschränkungen in Bezug auf die Operationsstelle. Die Unterkiefer-Seitenzähne, die durch die mit einem Zungenspatel gedrückte Zunge geschützt werden, sind oft nicht deutlich zu erkennen. Daher ist das Verfahren nur für Operationen an den Oberkieferzähnen oder Unterkieferfrontzähnen geeignet. Wenn die Operation länger als 20 Minuten dauert, wird empfohlen, der Maus alle 10 Minuten eine Pause zu gönnen, da die Stabilität des Mundknebels davon abhängt, dass die Okklusionskraft der Maus antagonisiert wird. C57-Mäuse, die aufgrund ihrer schnellen Vermehrung und Verfügbarkeit ausgewählt wurden, reagieren empfindlich auf verschiedene Reize; Daher kann eine leichte Überdosierung von Medikamenten oder Reizen tödlich sein. Darüber hinaus erfordert die geringe Größe der Zähne ein höheres Maß an Fähigkeiten beim Schneiden von Gewebe.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Pulpaentzündungen und Nekrosen drängende Herausforderungen bei der Pulparegeneration darstellen. Diese Studie bietet eine umfassende Demonstration der Erstellung eines Pulpitis-Modells bei Mäusen, wobei Immunfluoreszenzergebnisse die Entzündungsfaktoren bestätigen. In diesem Artikel wird ein neuartiges, praktisches Mundknebel-Design vorgestellt, das dem Bediener eine ungehinderte Sicht ermöglicht, indem es den Mund der Maus offen hält, ohne dass die Zunge stört. Operationen an den Unterkiefer-Seitenzähnen bleiben jedoch eine Herausforderung. In Anbetracht der Vorteile der Verwendung von Versuchsmäusen ist die endodontische Modellierung bei Mäusen vielversprechend, und es ist geplant, weitere Reduzierungen der technischen Schwelle zu erwarten.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Acknowledgments
Diese Studie wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China U21A20368 (L. Y.), 82101000 (H. W.) und 82100982 (F. L.) sowie durch das Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.) finanziert. Alle Originaldaten und Bilder sind in diesem Artikel enthalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| C57/B6J mice | Gempharmatech Experimental Animals Company | C57/B6J | For the establishment of pulp exposure |
| Equipment | |||
| 1 mL syringe | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | Apply in drug injection. |
| 8# C+ file | Readysteel | 0010047 | Apply in exposing the roof of pulp chamber. |
| Anesthesia Mix solution | 10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline. | ||
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus. |
| Dental high-speed dental handpiece | Jing yuan electronic commerce technology | WJ-422 | Apply in pulp exposure. |
| Heavy wire cutter | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply inarc cutting. |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | BL700B | For the histological analysis of the slides. |
| IL-6 antibody | Novus | NBP2-89149 | Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp. |
| Ketamine(Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | 100mg/kg, IP. Apply in nesthetization. |
| Medical tap | 3M | 1530 | Apply in mice immobilization. |
| Orthodontic arch wire | Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD. | K417 | Diameter of 8µm |
| Round dental burr (0.6 mm) | Shofu global | 072208 | Apply in removing enamel and shallow layer of dentin. |
| Young loop bending plier | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply in arc bending. |
References
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