清醒小鼠的高血糖钳夹和低血糖钳夹

Summary

高血糖钳夹用于测量胰岛素释放，并维持较高的血糖浓度。降糖钳夹用于测量由反调节反应引起的葡萄糖产生。两种方法都使用相同的外科手术。在这里，我们提出了一种钳夹技术来评估全身葡萄糖代谢。

Abstract

糖尿病 （DM） 是由胰腺β细胞释放的胰岛素不足 （Type1 DM） 和肌肉、肝脏和脂肪组织中的胰岛素敏感性 （Type2 DM） 引起的。胰岛素注射治疗糖尿病患者，但会导致低血糖作为副作用。皮质醇和儿茶酚胺被释放以激活肝脏产生的葡萄糖以恢复低血糖，称为反调节反应 （CRR）。在使用啮齿动物模型的 DM 研究中，葡萄糖耐量试验和 2-脱氧葡萄糖注射液分别用于测量胰岛素释放和 CRR。然而，在实验过程中，血糖浓度持续变化，导致评估净胰岛素释放量和 CRR 的困难。本文描述了一种将清醒小鼠的血糖保持在 250 mg/dL 或 50 mg/dL 的方法，以分别比较胰岛素和 CRR 激素的释放。

将聚乙烯管植入小鼠的颈动脉和颈静脉，让小鼠从手术中恢复。颈静脉管通过注射泵连接到汉密尔顿注射器，以恒定和可变的速率输注胰岛素或葡萄糖。颈动脉管用于采血。对于高血糖钳夹，将 30% 的葡萄糖注入静脉，每 5 分钟或 10 分钟从动脉血中测量血糖水平。增加 30% 葡萄糖的输注速率，直到血糖水平变为 250 mg/dL。收集血液以测量胰岛素浓度。对于低血糖钳夹，将 10 mU/kg/min 胰岛素与 30% 葡萄糖一起输注，其输注速率可变以维持 50 mg/dL 的血糖水平。当葡萄糖输注和血糖都达到稳定状态时，收集血液以测量反调节激素。高血糖钳和低血糖钳具有相同的外科手术和实验设置。因此，该方法对全身葡萄糖代谢的研究人员很有用。

Introduction

葡萄糖是细胞的重要能量来源，缺乏葡萄糖会导致各种症状和并发症。在低血糖（低血糖，空腹血糖水平通常低于 70 mg/dL，但不应由单一值¹ 确定）的情况下，最常见的症状包括虚弱、意识模糊、出汗和头痛。它还可能破坏大脑功能，增加心血管事件和死亡的风险²。相反，高血糖症是一种血浆葡萄糖浓度超过正常水平（空腹血糖^{水平 3} 通常> 126 mg/dL）的疾病。这可能发生在胰岛素产生或利用不足的糖尿病患者身上。高血糖症可导致糖尿病酮症酸中毒，当身体不能使用葡萄糖作为能量，而是分解脂肪酸作为燃料时，就会发生这种情况。高血糖高渗状态也会增加死亡率⁴.长期高血糖会对血管、神经和器官造成损害，导致心血管疾病、视网膜病变和肾脏疾病等多种慢性并发症的发展。因此，血糖浓度必须保持在 100 mg/dL 和 120 mg/dL 之间的严格范围内。

在单室模型中，血糖由葡萄糖输入和输出之间的平衡调节（图1A）。葡萄糖输入包括从食物中吸收的葡萄糖和从肝脏、肾脏和小肠产生的葡萄糖。葡萄糖输出包括组织中的葡萄糖摄取和肾脏的葡萄糖处理。葡萄糖输入量和输出量均受内分泌激素调节。例如，胰高血糖素、皮质酮和儿茶酚胺（称为反调节激素）在血糖水平降低时释放⁵.它们刺激糖原的分解和葡萄糖的合成，主要来自肝脏;这些过程分别称为糖原分解和糖异生。高血糖会增加胰腺β细胞释放的胰岛素，并刺激肌肉、脂肪组织和心脏的葡萄糖摄取 6,7,8,9。运动可增加胰岛素依赖性葡萄糖的摄取¹⁰.交感神经系统增加肌肉和棕色脂肪组织中的葡萄糖摄取 ^6,11。为了测量调节外周组织中葡萄糖代谢的能力，研究人员通常使用葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）（图1B，C）。在GTT中，必须考虑两个因素：胰岛素释放和胰岛素敏感性（图1B）。然而，每只小鼠在120分钟测试期间的葡萄糖浓度曲线不同，这可能会影响不同量的激素释放。在ITT中，血糖受胰岛素敏感性和反调节激素释放的调节。因此，在血糖水平不恒定的情况下，很难确定 GTT 和 ITT 中葡萄糖代谢、胰岛素释放和胰岛素敏感性的确切含义。

为了克服这些问题，希望将血糖保持在恒定水平（或“钳制”）。在高血糖钳夹中，葡萄糖被注入血液中，将血糖水平提高到特定水平，然后维持在该水平一段时间。每 5-10 分钟根据血糖水平的测量值调整输注葡萄糖的量，以保持稳定状态。该技术对于了解钳制葡萄糖水平下胰岛素分泌的参数特别有用。降糖钳夹是一种通过输注胰岛素来维持低血糖水平的方法。葡萄糖以可变速率输注以维持特定的血糖水平。如果小鼠无法从低血糖中恢复，则应输注更多的葡萄糖。

尽管进行高血糖和低血糖钳夹有很多优点，但手术和实验程序在技术上被认为是困难的。因此，很少有研究小组能够做到这一点。我们旨在为有财务和劳动力限制的研究人员描述这些方法，以较低的预算开始这些实验。

Protocol

所有程序均由熊本大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准。

注意：为了缓解疼痛，布洛芬在饮用水（0.11mg / mL）中给予48小时，并在手术前30分钟给予丁丙诺啡（0.05-0.1mg / kg ip）。无菌条件包括手套、口罩和在动物之间用环氧乙烷灭菌的高压灭菌器械。手术在设置为37°C的加热垫上进行，并为每只动物覆盖一个新的实验室垫。手术前，用甜菜碱溶液和酒精清洁手术区域。所有手术器械均用高压灭菌器灭菌（不超过两次手术）。在进行切口之前，对小鼠进行检查以确保它们完全麻醉。在手术前和手术期间通过捏脚趾来评估每只小鼠的麻醉深度。适应期每次不超过5分钟。遵循相应机构 IACUC 的指示。

1.颈静脉和颈动脉管的制备

1. 用高压灭菌器或环氧乙烷对所有管路、聚丙烯用品（例如移液管吸头）和缝合线进行灭菌。对于颈静脉，使用胶水连接 8 cm 的管子 1（见 材料）和 3 cm 的管子 2（图 2A）。将 2 毫米的管子 1 放在顶部，因为管子 2（聚乙烯）太硬，可能会损坏血管 （管路 1.1）。
2. 颈静脉延长管（Tubing1.2），用于输注葡萄糖和胰岛素
   1. 准备两个 30 cm 管和一个带管 2 的 10 cm 管（图 2A）。切断 20 μL 移液器吸头的尖端（或任何尖端端窄且外径为 0.5 mm <以与管路 1.1 连接）的尖端，并将三根管路 2（30 cm、30 cm 和 10 cm）一起放入其中。用胶水密封。
   2. 将 5 厘米的管子 1 放在管子的另一端 2.
3. 对于颈动脉（Tubing1.3）：拉伸Tubing2使其更薄。用胶水连接 8 cm 的管子 1 和 3 cm 的拉伸管 2（图 2A）。在距尖端 9 毫米处做一个标记。
4. 将管子连接到注射器的非锋利端的针头：用金属锉刀在针头的尖头（23 G）附近划伤，用钳子轻轻地来回弯曲几次，然后折断。在针的中间做同样的切割，做成一块金属连接器（图2A）。
5. 动脉抽血延长管（管组1.4）：将10厘米的管子1与步骤1.4中制作的金属接头和非锋利针头连接。
   注意：所有管子和缝合线都用高压灭菌器或环氧乙烷灭菌

2. 手术

1. 用异氟醚（1.5-2.0%）或氯胺酮/甲苯噻嗪（氯胺酮10mg / mL，甲苯噻嗪1mg / mL在0.9%无菌盐水中，0.1mL / 10g体重（BW）通过腹膜内注射[ip]注射）麻醉小鼠。将鼠标放在温暖的垫子（37°C）上以减轻物理压力。等待深度麻醉5-10分钟。通过踏板反射、呼吸和心率确认麻醉深度，并通过捏脚趾来确认对刺激的反应。在手术过程中，应使用手术胶带将鼻盖固定在手术台上，以便连续吸入麻醉剂。将眼药膏涂抹在眼睛上，以防止麻醉时干燥。
2. 将肝素盐水（100 U / mL）填充在管1.1和1.3中，并用带有非锋利针头的1 mL注射器连接它们（图2B）。用烙铁熔化管3（见 材料表）的末端，将其熔化，烙铁将用作管1.1和管1.3的盖子。
3. 剃须并擦拭第一个（背部肩胛间）和第二个（前颈部）切口区域，用三个周期的 10% 甜菜碱，然后用无菌 70% 酒精进行术前准备。在胸骨头部做一个 5 mm 的小垂直中线切口，钝解剖组织，暴露动脉。将迷走神经与动脉分开。这减少了切除迷走神经对葡萄糖代谢的负面影响。
   注意：从腹侧切口到将导管插入静脉并用丝缝线固定的步骤是在显微镜下进行的。
4. 在动脉下放置两条丝绸缝合线。通过在颅侧紧紧绑住一条缝合线（图 2C-1）和在尾侧松绑另一条缝合线（图 2C-2）来阻止血流，这足以阻止血流，但足以稍后再次打开。在动脉下再缝合一根缝合线（图2C-3）。
5. 用弹簧剪刀剪开图 2C-1 附近的动脉，并将管子 1.3 放入动脉中。在动脉和管道上打一个松散的领带（图 2C-3，不要绑得很紧。管道将更深地插入动脉）。打开尾侧的结（图 2C-2）插入管子，直到 9 毫米标记到达中间的结（图 2C-3）。牢固地绑住所有结扎线并用肝素化的无菌盐水冲洗。
6. 从与颈静脉右颈动脉相同的切口暴露右颈静脉，用于颈静脉导管。隔离颅端并用丝绸缝合线结扎（图2D-1，材料表）。在暴露静脉的尾端放置另一条缝合线（图 2D-2）。用弹簧剪刀剪开图 2D-1 标记附近的静脉。
7. 插入导管（不要太深以防止穿透血管），将其绑扎，并目视确认它正在采样血液。用肝素化无菌盐水 （0.2 mL） 冲洗，目视确认导管中没有血液残留。
8. 将鼠标放在新的无菌手术布上，以防止第一个伤口感染。将鼠标翻转过来，用三个周期的甜菜碱擦拭，然后用无菌酒精进行术前制剂，并在肩胛骨之间做一个小切口。
9. 将针架从背部切口穿过皮肤下，到达腹侧。用针架夹住导管，将它们穿过皮下，然后将它们带回。清洁切口部位并用合成缝合线（直径0.15-0.2mm）闭合腹侧切口。在肩胛骨之间的切口部位用微锯片夹住静脉导管。
10. 将导管切开 1 cm 处，用肝素盐水冲洗，然后用盖子将其关闭（步骤 2.4）。对动脉导管遵循相同的程序。用合成缝合线（直径0.15-0.2mm）闭合背部切口。
11. 将小鼠放在温暖，干净的笼子中（图2E）。每天进行术后护理。

3. 恢复

1. 单间小鼠，因为另一只小鼠可能会咬合组外壳中的导管。
   1. 为了减轻社会隔离带来的压力，请将小鼠与环境丰富的环境（例如，庇护所）保持在一起。每天进行术后护理。为了缓解疼痛、痛苦和不适，提供术后护理，包括镇痛（饮用水中的布洛芬 （0.11 mg/mL）。
   2. 观察小鼠是否有感染迹象，例如切口部位溃烂、嗜睡或疼痛。大多数健康小鼠在手术后约2小时开始行走和进食。驼背的姿势、褶皱的皮毛和食物摄入量减少可能表明疼痛。如果观察到这些迹象，请立即在深度麻醉或二氧化碳窒息下将其斩首，从而对小鼠实施安乐死。
2. 血液会进入动脉中的导管并形成凝块。为了维持导管管路，请每天按照步骤 3-6 清除凝块。
3. 用肝素盐水 （100 U/mL） 填充 1 mL 注射器和 23 G 针头（非尖头）。使用诱导室，用异氟烷（1.0%-1.5%）轻轻麻醉小鼠。然后，将小鼠从腔室中取出，并在异氟醚麻醉下用鼻盖进行凝块去除。
4. 用微锯精将动脉管夹在鼠标背面，取下盖子，提取血液和凝块。使用另一个 1 mL 注射器和 23 G 针头（非锋利端）用肝素化盐水冲洗导管并重新盖上盖子。在严重凝血的情况下，像动脉管一样清洁静脉管路。
5. 执行相同的程序，每天清理一次导管，持续 3-5 天。
6. 检查鼠标的体重。如果体重从手术当天开始减少 10% 以上，请应用支持性护理并尝试提高正常身体状况评分，然后使用鼠标进行另一个实验。
   注意：在本研究的实验中，动物的体重减轻不到10%。体重减轻会强烈影响全身葡萄糖代谢。因此，建议等待体重恢复或从夹具实验中移除。

4. 设置泵系统（用于降糖夹）

1. 在 0.1% BSA 盐水、30% 葡萄糖盐水和肝素盐水中制备 1 U/mL 胰岛素。
2. 测量鼠标的体重。计算 1 U/mL 胰岛素的体积以使胰岛素输注 （10 mU/kg/min）。在钳夹实验中将1.7μL / min的胰岛素溶液注入小鼠中。要使 300 μL 胰岛素输注，1 U/mL 胰岛素 （μL） 所需的体积为 2.647 （μL/g） x 体重 （g）。体积为300μL的胰岛素输注足以完成1只小鼠的钳夹实验。 表 1 显示了胰岛素输注的示例。
3. 在每个汉密尔顿注射器中填充胰岛素输注液和30%葡萄糖，将它们与管1.2连接，并将注射器放在注射泵上（图3A）。将每种溶液填充到管 1.2 中。在 1 mL 注射器和管组 1.4 中填充生理盐水（图 2A）。
4. 用异氟醚（1.0%-1.5%）麻醉小鼠，并将管路1.2连接到静脉导管，将管组1.4连接到动脉导管（图3A）。使用玻璃纸胶带将管子固定在一起。
5. 将鼠标放入空的500mL烧杯中。
   注意：对于高血糖钳夹，使用生理盐水代替 1 U/mL 胰岛素。

5.降糖钳夹

1. 每 5-10 分钟测量一次血糖水平，如 图 3B 所示，并在 -15 分钟、10 分钟、20 分钟、40 分钟、60 分钟、80 分钟、100 分钟和 120 分钟收集血液样本进行激素测量。按照步骤 5.2 测量血糖。
   注意：没有必要在所有时间点测量血糖，但建议至少每 10 分钟测量一次。当血糖水平和葡萄糖输注速率不稳定时，每 5 分钟测量一次血糖。
2. 夹住管组 1.4 的顶端并连接新注射器，提取 50 μL 血液，并将其放入 1.5 mL 管中进行清洗。测量血糖水平。
   注意：这是在上次采样后因导管清洗而被管中的盐水溶液稀释的血液。50 μL 体积足以用纯血代替稀释的血液。
3. 储存稀释的血液（红细胞）。用生理盐水洗涤合并的血液（~500μL）（见步骤5.11-5.12）并返回体内以防止缺氧。
4. 导管与高血压动脉相连，因此当夹子松开时，血液会流出并用方便的血糖仪测量血糖。输注 50 μL 生理盐水以保持足够量的血液。
5. 对于血液采样，再提取 50 μL 血液并将其放入 1.5 mL 冰管中。输注 100 μL（50 μL 置换液 + 50 μL 取样液）生理盐水。
6. 血糖测量0分钟后，启动胰岛素注射泵。首先，在推注中输注 30 mU/kg/min，持续 2 分钟（5.1 μL/min），然后在剩余的时间内输注 10 mU/kg/min （1.7 μL/min）。
7. 测量血糖水平，每5-10分钟改变一次葡萄糖输注速率，持续120分钟。
8. 创造一个稳定状态，其中葡萄糖输注速率不改变，血糖水平为 50 mg/dL。
9. 在t = 120分钟收集血液样本后，将安乐死剂注入颈静脉并收集组织进行RNA或蛋白质分析。
10. 以1000× g 离心血液5分钟，并根据制造商的方案使用ELISA试剂盒测量激素浓度，如胰岛素或c肽。
11. 洗血时，将血液以1000× g 离心3分钟。取出上清液，加入500μL肝素化盐水，然后进行移液。
12. 再次重复洗涤，并将洗涤的红细胞放入动脉注射器中。当在步骤 5.2 和 5.3 中输注 50 或 100 μL 生理盐水时，血细胞将自动重新输注。仔细监测血细胞比容以防止缺氧。
    注意：对于血糖测量，使用了商用便携式血糖仪。

6. 高血糖钳夹

1. 按照低血糖钳夹技术的步骤进行操作，但不输注胰岛素，并将血糖调整为 250-300 mg/dL。每 5-10 分钟测量一次血糖水平，如 图 3B 所示，并在 -15 分钟、10 分钟、20 分钟、40 分钟、60 分钟、80 分钟、100 分钟和 120 分钟收集血液样本进行激素测量。
2. 将新注射器连接到管路组1.4，抽取 50 μL 血液，并将其放入 1.5 mL 管中进行清洗。
3. 对于血液采样，再提取 50 μL 血液并将其放入 1.5 mL 冰管中。输注 100 μL（50 μL 置换液 + 50 μL 取样液）生理盐水。
4. 血糖测量0分钟后，启动葡萄糖注射泵。首先，在推注中输注 30 g/kg/min，持续 2 分钟（5.1 μL/min），然后在剩余的时间内以 10 g/kg/min （1.7 μL/min） 输注。
5. 测量血糖水平，每5-10分钟改变一次葡萄糖输注速率，持续120分钟。创造一个葡萄糖输注速率不变的稳定状态，血糖水平为250-300mg/dL，一种钳夹的高血糖状态。

Representative Results

在实验开始时禁食3小时的雄性C57BL / 6N小鼠（8周龄，超过25g BW）中进行低血糖钳研究（图4A，B）。初始血糖水平为 136 mg/dL （t = -15 min）。如果低于 90 mg/dL，可能是因为手术不顺利，或者动脉导管插入太深，或者血凝块进入血流。手术后的小鼠状况会影响小鼠的能量代谢。在健康状况不佳的情况下，无法测量生理葡萄糖代谢。C57BL术后更容易凝血;体重较高的小鼠，如FVB或ICR小鼠，由于手术后血栓清洗而不太可能减肥。因此，初学者最好使用 FVB 鼠标练习夹具程序。C57BL小鼠需要更多的重症监护。将 9 毫米导管插入动脉并没有给我们带来任何采血麻烦，即使在 FVB 和 ICR 小鼠中也是如此。胰岛素在t = 0分钟时开始，血糖水平降低（图4A）。GIR 在 t = 0 min 和 t = 70 min 之间不稳定。随后，80分钟后进入稳定状态。

在实验开始时禁食3小时，雄性C57BL / 6N小鼠（8周龄，超过25g BW）中也进行了高血糖钳夹研究（图4C，D）。在t = -15和t = -5 min测量血糖并收集血样后，从t = 0 min输注葡萄糖。在t = 40分钟时，血糖水平变为250 mg/dL。稳态从 t = 30 分钟持续到结束。

图1：血糖水平的调节。 （A） 说明体内血糖调节的概念图。（乙、丙）（B）葡萄糖耐量试验（GTT）和（C）胰岛素耐量试验（ITT）中葡萄糖代谢的调节。有几个因素调节血糖水平。 请点击这里查看此图的较大版本.

图2：管路的准备和手术步骤。 （A） 颈动脉和颈静脉导管的图像。管路编号与协议步骤编号匹配。（B）手术用管子的制备方法。（C、 D）结扎丝线以将导管插入 （C） 动脉和 （D） 静脉的编号位置。丝线在动脉颅侧 （C-（1）） 和尾侧 （C-（2）） 的位置，以及它们中间的另外一根丝线的位置 （C-（3））（程序 2-4）。丝线在颅骨 （D-（1）） 和静脉尾侧 （D-（2）） 中的位置，以及它们中间的另外一根丝线的位置 （D-（3））（程序 2-6）。（E） 动脉插管和静脉插管从背部排出的示意图 请点击这里查看此图的较大版本.

图 3：夹具的设置。 （A） 显示管道、泵、注射器和鼠标设置的图表。（B） 记录血糖水平和葡萄糖输注速率的表格。在t = -15分钟，10分钟，20分钟，40分钟，60分钟，80分钟，100分钟和120分钟时收集50μL血液。从 t = 0 到 2 分钟，胰岛素输注速率为 5.1 μL/min，在 t = 2 分钟时变为 1.7。每 10 分钟测量一次血糖水平。当血糖水平不稳定时，每 5 分钟测量一次血糖。每次测量血糖时，葡萄糖输注速率都会改变。 请点击这里查看此图的较大版本.

图4：降糖钳夹和高血糖钳夹的代表性结果。 （A）血糖水平和（B）降糖钳的葡萄糖输注速率。（C）血糖水平和（D）高血糖钳的葡萄糖输注速率。数据代表平均值±SEM。 请点击这里查看此图的较大版本.

溶液	计算	对于 20 克鼠标
1 U/mL 胰岛素	（2.647 x 体重） μL	52.9微升
0.1%BSA盐水	300 μL - 胰岛素体积 （μL）	247.1微升

表1：胰岛素输注制备的计算示例。

Discussion

这里描述的方法很简单，可以使用移液器吸头、注射器和普通实验室中的其他物品来完成。尽管研究人员可能需要购买额外的管子和泵，但不需要昂贵的设备。因此，与以前的报告相比，这种导管插入术和钳夹术方案更容易开始12,13,14。

钳夹技术是在 1970 年左右开发的，已用于小鼠和人类¹⁵。它是准确测量葡萄糖代谢的有用方法，据说是金标准。然而，这并不是许多研究人员使用的常用技术。在小鼠¹³ 和大鼠¹⁴ 中已经报道了高胰岛素-正常血糖钳夹技术，但这里的导尿方法不同，读者可以选择更简单的方法进行实验。本文的目的之一是减少开始实验的障碍。因此，我们提供了有关手工导管材料、外科手术和实验时间过程示例的详细信息。这些对于第一次尝试进行夹具的研究人员来说是有用的。

肥胖症和糖尿病患者的胰岛素分泌是分期依赖性的。许多报告表明，在胰岛素抵抗状态下，肥胖时胰岛素分泌增加以降低血糖¹⁶，但在 2 型 DM 中，β细胞功能会受损^17,18。事实上，据报道，胰岛和胰岛素分泌的数量和面积在肥胖小鼠模型中增加，例如喂食高脂肪饮食^的小鼠19或瘦素缺乏小鼠²⁰。在这些具有明显表型的小鼠模型中，可以通过在GTT中葡萄糖给药后15-30分钟检查血液胰岛素水平来确定差异。然而，在某些情况下，确定胰岛素分泌的差异并不容易。例如，如果转基因 （Tg） 小鼠的血糖水平为 500 mg/dL，而 WT 小鼠的血糖水平为 300 mg/dL，并且两只小鼠的血液胰岛素水平相同，我们是否可以说 Tg 的胰岛素分泌减少？在这种情况下，除非使用此处介绍的方法使血糖水平相同，否则我们无法比较胰岛素分泌能力。这就是为什么没有关于β细胞功能在从肥胖到糖尿病的过渡中何时开始恶化的既定理论的原因之一。我们还可以通过胰腺²¹或离体²²的原代培养来测量胰岛素分泌。然而，它会破坏中枢神经系统对胰岛素释放的影响，因为迷走神经的神经支配将被移除。吸收后胰岛素分泌是众所周知的，但大脑和自主神经系统也调节胰岛素的释放²³。分析后者的实验应在未麻醉，无限制，无痛的采血中进行。这也是为什么在步骤2.3中必须将迷走神经与颈动脉分开的原因。

据报道，由于胰岛素抵抗和胰高血糖素²⁴ 和其他反调节激素²⁵ 分泌增加，糖尿病会导致高血糖。此外，由于胰岛素剂量失败或其他原因导致糖尿病患者反复发作的低血糖症可导致一种称为复发性低血糖症的病症，其中患者容易发生低血糖^症26。有人认为，低血糖钳夹中血糖的下降速率会影响低血糖的外周或中枢检测²⁷。缓慢起效的低血糖可能适合于研究葡萄糖传感器在门静脉中的作用，而血糖的非常快速下降可能适用于脑葡萄糖传感器^的研究27。1U / mL胰岛素用于瘦C57BL小鼠。但是，肥胖小鼠需要更高的胰岛素浓度，因为它们具有胰岛素抵抗，并且 1 U/mL 不足以降低血糖水平。

在血糖池的单室模型（图1A）中，吸收的葡萄糖量可能会影响葡萄糖输入^的速率14。因此，葡萄糖产生速率是测量高胰岛素 - 正常血糖钳夹的主要目标之一，可能会受到禁食持续时间的影响。然而，长时间的禁食可能会增加反调节激素的释放。因此，研究人员根据他们的分析目的设定禁食时间。另一种夹紧方法包括从尾巴取血，这很简单，因为只需要插入静脉插管¹⁴.然而，血液被收集在约束中，这会导致适度的约束压力和血浆儿茶酚胺和其他压力激素^的增加14。此外，最好测量身体中心血流中的激素浓度，而不是四肢血液中的激素浓度。因此，从自由移动的小鼠的动脉中取血是生理上测量葡萄糖代谢的最佳方法。小鼠不会四处走动，当它们适应实验环境时不需要旋转。但是，建议使用旋转装置以防止输液和采样管线缠结。管路1.2和管路组1.4（图3A）不适合使用旋转装置。如果研究人员需要使用旋转装置，则应改进该系统。血细胞的回输不影响血糖和胰岛素的既定稳定状态。本方法也适用于使用同位素的代谢组学研究。例如，如果 ^将13C-葡萄糖连续注入静脉中，则可以测量全身代谢周转率和细胞内中间代谢物²⁸。因此，这是分析葡萄糖代谢的有用方法。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive glue	Henkel AG & Co. KGaA	LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)	Morinaga Institute of Bilogical Science Inc	M1304	Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	633-03411	LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter	Nipro Co.	11-777	Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml)	Eli Lilly & Co.	428021014	Humulin R (100U/ml)
Mouse	Japan SLC Inc.	C57BL/6NCrSlc	C57BL
Suture	Natsume seisakusho	C-23S-560 No.2	Sterilized
Syringe Pump	Pump Systems Inc.	NE-1000
Synthetic suture	VÖMEL	HR-17
Tubing1	AS ONE Corporation	9-869-01	LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2	Fisher Scientific	427400	BD Intramedic PE Tubing
Tubing3	IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.	size5	Polyethylene tubing size5