Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Hyperglykemisk klämma och hypoglykemisk klämma hos medvetna möss

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65581
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

Summary

En hyperglykemisk klämma används för att mäta insulinfrisättningen med bibehållen högre blodsockerkoncentration. En hypoglykemisk klämma är till för att mäta glukosproduktion inducerad av motreglerande svar. Båda metoderna använder samma kirurgiska ingrepp. Här presenterar vi en klämteknik för att bedöma systemisk glukosmetabolism.

Abstract

Diabetes mellitus (DM) orsakas av otillräcklig insulinfrisättning från bukspottkörtelns β-celler (Typ1 DM) och insulinkänslighet i muskler, lever och fettvävnad (Typ2 DM). Insulininjektion behandlar DM-patienter men leder till hypoglykemi som biverkning. Kortisol och katekolaminer frisätts för att aktivera glukosproduktionen från levern för att återställa hypoglykemi, så kallad kontraregulatorisk respons (CRR). I DM-forskning med gnagarmodeller används glukostoleranstester och 2-deoxi-glukosinjektion för att mäta insulinfrisättning respektive CRR. Blodglukoskoncentrationerna förändras dock ihållande under experimenten, vilket gör det svårt att bedöma nettoinsulinfrisättning och CRR. Den här artikeln beskriver en metod där blodsockret hålls på 250 mg/dL eller 50 mg/dL hos medvetna möss för att jämföra frisättningen av insulin respektive CRR-hormoner.

Polyetylenslang implanteras i mössens halspulsåder och halsven, och mössen får återhämta sig från operationen. Jugularvenslangen är ansluten till en Hamilton-spruta med en sprutpump för att möjliggöra insulin- eller glukosinfusion med en konstant och variabel hastighet. Halspulsåderslangen är till för bloduppsamling. För den hyperglykemiska klämman infunderas 30 % glukos i venen, och blodsockernivåerna mäts från artärblodet var 5:e minut eller 10:e minut. Infusionshastigheten på 30 % glukos ökas tills blodsockernivån blir 250 mg/dL. Blod samlas in för att mäta insulinkoncentrationen. Vid hypoglykemisk klämma infunderas 10 mU/kg/min insulin tillsammans med 30 % glukos, vars infusionshastighet är variabel för att upprätthålla 50 mg/dL blodsockernivå. Blod samlas in för att mäta motreglerande hormoner när både glukosinfusion och blodsocker når ett stabilt tillstånd. Både hyperglykemiska och hypoglykemiska klämmor har samma kirurgiska ingrepp och experimentella uppställningar. Metoden är därför användbar för forskare inom systemisk glukosmetabolism.

Introduction

Glukos är en viktig energikälla för cellerna, och brist på glukos kan leda till en mängd olika symtom och komplikationer. I händelse av lågt glukos (hypoglykemi, i allmänhet mindre än 70 mg/dL i fasteblodsockernivån, men bör inte bestämmas av ett enda värde1), är de vanligaste symtomen svaghet, förvirring, svettning och huvudvärk. Det kan också störa hjärnfunktionen och öka risken för kardiovaskulära händelser och dödlighet2. Omvänt är hyperglykemi ett medicinskt tillstånd där plasmaglukoskoncentrationen överstiger normala nivåer (vanligtvis > 126 mg/dL i fasteblodsockernivå3). Detta kan inträffa hos personer med diabetes som antingen har ett underskott i insulinproduktion eller insulinutnyttjande. Hyperglykemi kan leda till diabetisk ketoacidos, som uppstår när kroppen inte kan använda glukos som energi utan istället bryter ner fettsyror som bränsle. Det hyperglykemiska hyperosmolära tillståndet ökar också dödligheten4. Långvarig hyperglykemi kan orsaka skador på blodkärl, nerver och organ, vilket leder till utveckling av flera kroniska komplikationer som hjärt- och kärlsjukdomar, retinopatier och njursjukdomar. Således måste blodsockerkoncentrationen hållas i ett snävt intervall mellan 100 mg/dL och 120 mg/dL.

Blodsockret regleras av balansen mellan glukostillförsel och glukosutmatning i en enkompartmentmodell (figur 1A). Glukostillförsel inkluderar absorberad glukos från mat och glukosproduktion från levern, njurarna och tunntarmen. Glukosproduktionen består av glukosupptag i vävnader och glukosavsättning från njurarna. Både mängden glukos som tillförs och produceras regleras av endokrina hormoner. Till exempel frigörs glukagon, kortikosteron och katekolaminer, kända som motreglerande hormoner, när blodsockernivåerna sjunker5. De stimulerar nedbrytningen av glykogen och syntesen av glukos, främst från levern; Dessa processer kallas glykogenolys respektive glukoneogenes. Hyperglykemi ökar insulinfrisättningen från bukspottkörtelns β-celler och stimulerar glukosupptaget i muskler, fettvävnad och hjärta 6,7,8,9. Motion ökar det insulinoberoende glukosupptaget10. Det sympatiska nervsystemet ökar glukosupptaget i muskler och brun fettvävnad 6,11. För att mäta förmågan att reglera glukosmetabolismen i perifera vävnader använder forskare vanligtvis glukostoleranstestet (GTT) och insulintoleranstestet (ITT) (Figur 1B,C). I GTT måste två faktorer beaktas: insulinfrisättning och insulinkänslighet (figur 1B). Glukoskoncentrationskurvan under 120-minuterstestet är dock olika i varje mus, vilket kan påverka olika mängder hormonfrisättning. Vid ITT regleras blodsockret av både insulinkänslighet och frisättning av motreglerande hormoner. Därför är det svårt att fastställa den exakta innebörden av glukosmetabolism, insulinfrisättning och insulinkänslighet i GTT och ITT, i situationer där blodsockernivåerna inte är konstanta.

För att övervinna dessa problem är det önskvärt att hålla blodsockret på en konstant nivå (eller "klämma"). Vid hyperglykemisk klämma infunderas glukos i blodomloppet för att höja blodsockernivåerna till en viss nivå och bibehålls sedan på den nivån under en viss tid. Mängden infunderad glukos justeras baserat på mätningar av blodsockernivåer var 5-10:e minut för att upprätthålla ett stabilt tillstånd. Denna teknik är särskilt användbar för att förstå parametrarna för insulinutsöndring vid en fastspänd glukosnivå. Hypoglykemisk klämma är en metod för att upprätthålla låga blodsockernivåer genom att tillföra insulin. Glukos infunderas i varierande takt för att upprätthålla en specifik blodsockernivå. Om musen inte kan återhämta sig från hypoglykemi bör mer glukos tillföras.

Även om det finns många fördelar med att utföra hyperglykemiska och hypoglykemiska klämmor, anses de kirurgiska och experimentella ingreppen vara tekniskt svåra. Det är alltså få forskargrupper som har kunnat göra dem. Vi syftade till att beskriva dessa metoder för att forskare med ekonomiska och arbetskraftsmässiga begränsningar ska kunna starta dessa experiment till en lägre budget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla procedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Kumamoto University.

OBS: För smärtlindring gavs ibuprofen i dricksvatten (0,11 mg/ml) i 48 timmar, och buprenorfin (0,05-0,1 mg/kg i.p.) gavs 30 minuter före operationen. Sterila förhållanden inkluderar handskar, masker och autoklaverade instrument steriliserade med etylenoxid mellan djur. Operationen utfördes på en värmedyna inställd på 37 °C och täckt av en ny labbmatta för varje djur. Före operationen rengjordes operationsområdet med en betadinlösning och alkohol. Alla kirurgiska instrument steriliserades med en autoklav (för högst två operationer). Innan snittet gjordes kontrollerades mössen för att säkerställa att de var helt sövda. Anestesidjupet för varje mus bedömdes före och under operationen genom att nypa i tårna. Acklimatiseringsperioden var inte mer än 5 minuter varje gång. Följ instruktionerna från IACUC vid respektive institution.

1. Förberedelse av slangar för halsvenen och halspulsådern

  1. Sterilisera alla slangar, polypropentillbehör (t.ex. pipettspetsar) och suturer med en autoklav eller etylenoxid. För halsvenen, anslut 8 cm slang1 (se Material) och 3 cm slang2 med lim (Figur 2A). Lägg 2 mm slang1 ovanpå eftersom slang 2 (polyeten) är för hård och kan skada blodkärlen (slang 1.1).
  2. Förlängningsrör för halsvenen (Tubing 1.2) för infusion av glukos och insulin
    1. Förbered två 30 cm rör och ett 10 cm rör med slang2 (Figur 2A). Skär av den vassa änden av en 20 μL pipettspets (eller något som har en smal spetsände med OD < 0.5 mm för att ansluta till slang 1.1) och placera tre slangar2 (30 cm, 30 cm och 10 cm) tillsammans i den. Försegla med lim.
    2. Placera 5 cm slang1 i den andra änden av slangen2.
  3. För halspulsådern (slang 1.3): Sträck slangen2 för att göra den tunnare. Anslut 8 cm slang1 och 3 cm av den sträckta slangen2 med lim (Figur 2A). Gör en markering 9 mm från spetsen.
  4. Nål med icke-vass ände som ansluter slangen till sprutan: Repa nära den vassa änden av nålen (23 G) med en metallfil, böj den försiktigt fram och tillbaka några gånger med en tång och bryt den. Gör samma snitt i mitten av nålen för att göra en bit metallkontakt (Figur 2A).
  5. Förlängningsrör för artären för att dra blod (slangset 1.4): Anslut 10 cm slang1 med metallanslutningen och den icke-vassa nålen som gjordes i steg 1.4.
    OBS: Alla slangar och suturer steriliseras med en autoklav eller etylenoxid

2. Kirurgi

  1. Bedöva en mus med isofluran (1,5-2,0 %) eller ketamin/xylazin (ketamin 10 mg/ml, xylazin 1 mg/ml i 0,9 % steril koksaltlösning, 0,1 ml/10 g kroppsvikt (kroppsvikt) via intraperitoneal [ip] injektion). Håll musen på den varma dynan (37 °C) för att minska fysisk stress. Vänta på djup anestesi i 5-10 min. Bekräfta anestesidjupet genom pedalreflex, andning och hjärtfrekvens, och svar på stimuli genom att nypa ihop tårna. Under operationen ska kirurgtejp användas för att fästa nässkyddet på operationsbordet för kontinuerlig inandning av anestesi. Applicera ögonsalva i ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
  2. Fyll hepariniserad koksaltlösning (100 E/ml) i slang 1.1 och 1.3 och anslut dem med en 1 ml spruta med en icke-vass nål (Figur 2B). Stäng änden av slangen3 (se materialtabellen) genom att smälta den med en lödkolv, som kommer att användas som lock för slangar1.1 och slangar1.3.
  3. Raka och torka av det första (interscapular på baksidan) och andra (halsen på framsidan) snittområdet med tre cykler med 10 % betadin följt av ett preoperativt preparat med steril 70 % alkohol. Gör ett litet vertikalt snitt i mittlinjen 5 mm cefaliskt mot bröstbenet, trubbigt dissekera vävnaderna och exponera artären. Separera vagusnerven från artären. Detta minskar de negativa effekterna av att ta bort vagusnerven på glukosmetabolismen.
    OBS: Steget från ventralsnittet till steget där katetern förs in i venen och fästs med silkessuturer utförs under ett mikroskop.
  4. Placera två silkessuturer under artären. Stoppa blodflödet genom att knyta den ena suturen hårt på kranialsidan (Figur 2C-1) och den andra löst på den kaudala sidan (Figur 2C-2), vilket är tillräckligt för att stoppa blodflödet men tillräckligt för att öppna igen senare. Placera ytterligare en sutur under artären (Figur 2C-3).
  5. Skär av artären nära figur 2C-1 med fjädersax och placera slang 1.3 i artären. Gör ett löst band på både artären och slangen (Figur 2C-3, knyt inte ordentligt. Slangen kommer att föras djupare in i artären). Öppna knuten på stjärtsidan (Figur 2C-2) för att föra in röret tills 9 mm-märket når knuten i mitten (Figur 2C-3). Knyt alla ligaturer ordentligt och spola med hepariniserad steril koksaltlösning.
  6. Exponera höger halsven från samma snitt som den högra halspulsådern för jugulakatetern. Isolera kranialänden och ligera den med silkessutur (Figur 2D-1, Materialtabell). Placera ytterligare en bit sutur vid den kaudala änden av den exponerade venen (Figur 2D-2). Klipp av venen nära märket Figur 2D-1 med fjädersax.
  7. För in katetern (inte för djupt för att förhindra att kärlen tränger in), knyt den och bekräfta visuellt att den tar blodprov. Spola med hepariniserad steril koksaltlösning (0,2 ml) och bekräfta visuellt att inget blod finns kvar i katetern.
  8. Placera musen på det nya sterila operationsdraperiet för att förhindra infektion från det första såret. Vänd musen, torka av med tre cykler betadin följt av ett preoperativt preparat med steril alkohol och gör ett litet snitt mellan skulderbladen.
  9. För en nålhållare under huden från snittet på baksidan till den ventrala sidan. Kläm fast katetrarna med nålhållaren, för in dem under huden och för tillbaka dem. Rengör snittstället och stäng de ventrala snitten med en syntetisk sutur (diameter 0,15-0,2 mm). Kläm fast venkatetern med mikroserrafin vid snittstället mellan skulderbladen.
  10. Klipp av katetern 1 cm ovanför klämman, spola den med hepariniserad koksaltlösning och stäng den med ett lock (steg 2.4). Följ samma procedur för artärkatetern. Stäng det dorsala snittet med en syntetisk sutur (diameter 0,15-0,2 mm).
  11. Placera musen i en varm, ren bur (Figur 2E). Utför postoperativ vård dagligen.

3. Återkrav

  1. Enhusmusen eftersom en annan mus kan bita på katetern i grupphuset.
    1. För att minska stress genom social isolering bör du hålla möss med miljöberikning (t.ex. skydd). Utför postoperativ vård dagligen. För att lindra smärta, ångest och obehag, ge postoperativ vård, inklusive smärtlindring (ibuprofen i dricksvatten (0,11 mg/ml).
    2. Observera möss för tecken på infektion, såsom varighet, slöhet eller smärta vid snittstället. De flesta friska möss börjar gå och äta cirka 2 timmar efter operationen. En böjd hållning, rufsig päls och minskat matintag kan tyda på smärta. Om dessa tecken observeras, avliva omedelbart mössen genom att halshugga dem under djup anestesi eller koldioxidkvävning.
  2. Blod kommer in i katetern i artären och bildar en propp. För att upprätthålla kateterlinjerna, ta bort proppen dagligen enligt steg 3-6.
  3. Fyll en 1 ml spruta och 23 G nål (ej vass ände) med hepariniserad koksaltlösning (100 E/ml). Använd en induktionskammare och bedöva musen lätt med isofluran (1,0%-1,5%). Ta sedan bort musen från kammaren och utför avlägsnande av koagel under isofluranbedövning med nässkydd.
  4. Kläm fast slangen för artären på baksidan av musen med mikroserrefine, ta bort locket och extrahera blodet och blodpropparna. Spola katetern med hepariniserad koksaltlösning med en annan 1 ml spruta med en 23 G nål (icke-vass ände) och sätt tillbaka locket. Rengör venkatetern på samma sätt som artärslangen vid kraftig koagulering.
  5. Gör samma procedur för att rengöra katetern en gång om dagen i 3-5 dagar.
  6. Kontrollera musens kroppsvikt. Om kroppsvikten minskar med mer än 10 % från operationsdagen, tillämpa stödjande vård och försök att förbättra den normala kroppskonditionspoängen och använd musen för ett annat experiment.
    OBS: Viktminskningen hos djur var mindre än 10 % i försöken i denna studie. Viktminskning kommer starkt att påverka den systemiska glukosmetabolismen. Därför rekommenderas det att vänta på kroppsviktsåterhämtningen eller ta bort från klämexperimentet.

4. Ställ in pumpsystemet (för hypoglykemisk klämma)

  1. Förbered 1 E/ml insulin i 0,1 % BSA-saltlösning, 30 % glukos i saltlösning och hepariniserad saltlösning.
  2. Mät musens kroppsvikt. Beräkna volymen för 1 E/ml insulin för att få insulinet att spruta (10 mU/kg/min). Infundera 1,7 μL/min insulinlösning i mössen i klämexperimentet. För att göra 300 μL insulininfusion är den erforderliga volymen för 1 E/ml insulin (μL) 2,647 (μL/g) x kroppsvikt (g). En volym på 300 μL insulininfusat är tillräckligt för att avsluta klämexperimentet på 1 mus. Tabell 1 visar ett exempel på hur insulininfusion kan göras.
  3. Fyll insulininfusionsmedel och 30 % glukos i varje Hamilton-spruta, anslut dem med slang 1.2 och ställ in sprutan på sprutpumpen (Figur 3A). Fyll varje lösning i slang 1.2. Fyll koksaltlösning i en 1 ml spruta och slangsats 1.4 (Figur 2A).
  4. Bedöva musen med isofluran (1,0–1,5 %) och anslut slang1,2 till venkatetern och slangsetet1,4 till artärkatetern (Figur 3A). Använd cellofantejp för att hålla ihop rören.
  5. Placera musen i en tom 500 ml bägare.
    OBS: För hyperglykemisk klämma, använd koksaltlösning istället för 1 E/ml insulin.

5. Hypoglykemisk klämma

  1. Mät blodsockernivåerna var 5-10:e minut, som visas i figur 3B, och ta blodprover för hormonmätningar vid -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min och 120 min. Följ steg 5.2 för att mäta blodsockret.
    OBS: Det är inte nödvändigt att mäta blodsockret vid alla tidpunkter, men det rekommenderas att mäta det minst var 10:e minut. Mät blodsockret var 5:e minut när dess nivå och glukosinfusionshastighet inte är stabila.
  2. Kläm fast den övre änden av slangsatsen1.4 och anslut en ny spruta, extrahera 50 μL blod och placera den i ett 1.5 ml rör för tvätt. Mät blodsockernivån.
    OBS: Detta är blodet som späds ut av koksaltlösningen i sonden på grund av katetertvätt efter föregående provtagning. En volym på 50 μL räcker för att ersätta utspätt blod med rent blod.
  3. Förvara det utspädda blodet (röda blodkroppar). Skölj det ansamlade blodet (~500 μL) med koksaltlösning (se steg 5.11-5.12) och återgå till kroppen för att förhindra hypoxi.
  4. Katetern är ansluten till artären med högt blodtryck, så när klämman lossas kommer blodet att rinna ut och användas för att mäta glukos med en praktisk glukosmätare. Infundera 50 μL saltlösning för att hålla tillräckligt med blodvätska.
  5. För blodprovstagning, extrahera ytterligare 50 μL blod och placera det i ett 1,5 ml rör på is. Infundera 100 μL (50 μL ersättning + 50 μL provtagning) koksaltlösning.
  6. Efter 0 minuters blodsockermätning, starta insulinsprutpumpen. Infundera först 30 mU/kg/min i bolus i 2 minuter (5,1 μL/min), sedan 10 mU/kg/min (1,7 μL/min) infusion under resten av varaktigheten.
  7. Mät blodsockernivån och ändra glukosinfusionshastigheten var 5-10:e minut i 120 minuter.
  8. Skapa ett stabilt tillstånd där glukosinfusionshastigheten inte förändras och blodsockernivån är 50 mg/dL.
  9. Efter att ha tagit blodprovet vid t = 120 min, infundera ett eutanasimedel i halsvenen och samla in vävnader för RNA- eller proteinanalys.
  10. Centrifugera blodet med 1000 x g i 5 minuter och mät hormonkoncentrationen såsom insulin eller c-peptid med hjälp av ett ELISA-kit enligt tillverkarens protokoll.
  11. För att tvätta blodet, centrifugera blodet med 1000 x g i 3 minuter. Ta bort supernatanten, tillsätt 500 μL hepariniserad koksaltlösning och utför pipettering.
  12. Upprepa tvätten igen och placera de tvättade röda blodkropparna i 1 ml spruta för artären. Blodkropparna återinfunderas automatiskt när 50 eller 100 μl koksaltlösning infunderas i steg 5.2 och 5.3. Övervaka hematokrit noggrant för att förhindra hypoxi.
    OBS: För blodsockermätning användes en kommersiell praktisk glukosmätare.

6. Hyperglykemisk klämma

  1. Följ stegen som hypoglykemisk klämteknik, men utan insulininfusion och med blodsockret justerat till 250-300 mg/dL. Mät blodsockernivåerna var 5-10:e minut, som visas i figur 3B, och ta blodprover för hormonmätningar vid -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min och 120 min.
  2. Anslut en ny spruta till slangsatsen1,4, extrahera 50 μl blod och placera den i ett 1,5 ml rör för tvätt.
  3. För blodprovstagning, extrahera ytterligare 50 μL blod och placera det i ett 1,5 ml rör på is. Infundera 100 μL (50 μL ersättning + 50 μL provtagning) koksaltlösning.
  4. Efter 0 minuters blodsockermätning, starta glukossprutpumpen. Låt först 30 g/kg/min infunderas i bolusen i 2 minuter (5,1 μL/min), sedan 10 g/kg/min (1,7 μL/min) under resten av varaktigheten.
  5. Mät blodsockernivån och ändra glukosinfusionshastigheten var 5-10:e minut i 120 minuter. Skapa ett stabilt tillstånd där glukosinfusionshastigheten inte förändras och blodsockernivån är 250-300 mg/dL, ett klämt hyperglykemiskt tillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den hypoglykemiska klämstudien utfördes på hanmöss av typen C57BL/6N (8 veckor gamla, mer än 25 g kroppsvikt) som fastade 3 timmar i början av försöket (Figur 4A,B). Den initiala blodsockernivån var 136 mg/dL (t = -15 min). Om det är mindre än 90 mg/dL kan det antingen bero på att operationen inte gick bra, eller att artärkatetern sattes in för djupt, eller att blodproppar har kommit in i blodflödet. Musens tillstånd efter operationen påverkar energiomsättningen i musen. Fysiologisk glukosmetabolism kan inte mätas under dåliga hälsoförhållanden. C57BL är mer benägen att koagulera efter operation; möss som har en högre kroppsvikt, såsom FVB- eller ICR-möss, är mindre benägna att gå ner i vikt på grund av propptvätt efter operationen. Därför är det bättre för nybörjare att använda FVB-möss för att öva på klämprocedurer. C57BL-möss kräver mer intensivvård. Införandet av 9 mm kateter i artären har inte gett oss några problem med att samla blod, inte ens hos FVB- och ICR-möss. Insulinbehandling påbörjades vid t = 0 min och blodsockernivåerna sjönk (Figur 4A). GIR hade inte varit stabil mellan t = 0 min och t = 70 min. Därefter blev det steady state efter 80 min.

Den hyperglykemiska klämstudien utfördes också på hanmöss av typen C57BL/6N (8 veckor gamla, mer än 25 g kroppsvikt) som fastade 3 timmar i början av försöket (Figur 4C,D). Efter mätning av blodglukos och blodprov vid t = -15 och t = -5 min, infunderas glukos från t = 0 min. Blodsockernivån blev 250 mg/dL vid t = 40 min. Steady state fortsatte från t = 30 min till slutet.

Figure 1
Figur 1: Reglering av blodsockernivåer. (A) Konceptuellt diagram som illustrerar regleringen av blodglukos i kroppen. (B,C) Reglering av glukosmetabolismen i (B) glukostoleranstest (GTT) och (C) insulintoleranstest (ITT). Flera faktorer reglerar blodsockernivåerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Förberedelse av slangar och steg i operationen. (A) Bilder av slangar för halspulsådern och halsvenen. Slangnumren stämmer överens med protokollstegnumren. (B) Metod för att förbereda slangarna för operation. (C, D) De numrerade positionerna där silkestrådarna ligeras för att föra in katetern i (C) artären och (D) venen. Silkestrådarnas placering i kraniet (C-(1)) och den kaudala sidan av artären (C-(2)), och ytterligare en i mitten av dem (C-(3)) (procedur 2-4). Silkestrådarnas placering i kraniet (D-(1)) och svanssidan av venen (D-(2)), och ytterligare en i mitten av dem (D-(3)) (procedur 2-6). (E) Diagram över arteriella och venösa kanyler som lämnar ryggen Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Bild 3: Inställning av klämman. (A) Diagram som visar inställningen av slangar, pumpar, sprutor och musen. (B) Blad för att registrera blodsockernivåer och glukosinfusionshastighet. 50 μL blod samlas upp vid t = -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min och 120 min. Insulininfusionshastigheten var 5,1 μL/min från t = 0 till 2 min och ändrades till 1,7 vid t = 2 min. Blodsockernivån mättes var 10:e minut. Blodsockret mättes var 5:e minut när nivån inte var stabil. Glukosinfusionshastigheten ändrades varje gång blodsockret mättes. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Representativa resultat av hypoglykemisk klämma och hyperglykemisk klämma. (A) Blodsockernivåer och (B) glukosinfusionshastighet för hypoglykemisk klämma. (C) Blodsockernivåer och (D) glukosinfusionshastighet för den hyperglykemiska klämman. Data representerar medelvärdet ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Lösning Beräkning För 20 g mus
1 E/ml insulin (2,647 x kroppsvikten) μL 52,9 μL
0,1 % BSA saltlösning 300 μL - volym insulin (μL) 247,1 μL

Tabell 1: Ett räkneexempel för beredning av insulininfusion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden som beskrivs här är enkel och kan göras med pipettspetsar, sprutor och andra föremål som finns i vanliga laboratorier. Även om forskare kan behöva köpa ytterligare slangar och pumpar behövs ingen dyr utrustning. Således är detta protokoll för kateterisering och klämma lättare att starta jämfört med tidigare rapporter 12,13,14.

Klämtekniken utvecklades runt 1970 och har använts på möss och människor15. Det är en användbar metod för att noggrant mäta glukosmetabolismen och sägs vara guldstandarden. Det är dock inte en vanlig teknik som används av många forskare. Den hyperinsulinemisk-euglykemiska klämtekniken har rapporterats hos möss13 och råttor14, men metoden för kateterisering här är annorlunda, och läsarna kan välja den enklare för sina experiment. Ett av syftena med denna uppsats är att minska hindret för att starta ett experiment. Därför gav vi detaljerad information om materialen för handgjorda katetrar, kirurgiska ingrepp och ett exempel på experimentellt tidsförlopp. Dessa är informativa för forskaren som försöker utföra clamp första gången.

Insulinutsöndringen vid fetma och diabetes är stadieberoende. Många rapporter tyder på att insulinutsöndringen ökar vid fetma för att sänka blodsockret i det insulinresistenta tillståndet16, men β-cellernas funktion kommer att skadas vid typ 2 DM17,18. Faktum är att antalet och arean av bukspottkörtelns öar och insulinutsöndring har rapporterats öka i modeller av fetmamöss, såsom möss som matats med en fettrik kost19 eller möss med leptinbrist20. I dessa musmodeller, som har en uppenbar fenotyp, kan skillnader bestämmas genom att undersöka insulinnivåerna i blodet 15-30 minuter efter glukosadministrering i GTT. I vissa fall är det dock inte lätt att fastställa skillnaderna i insulinutsöndring. Till exempel, om transgena (Tg) möss har en blodsockernivå på 500 mg/dL medan en WT-mus har 300 mg/dL och båda mössen har samma insulinnivå i blodet, kan vi säga att insulinutsöndringen minskar i Tg? I det här fallet kan vi inte jämföra insulinutsöndringen om inte blodsockernivåerna är desamma med den metod som introduceras här. Det är en av anledningarna till att det inte finns någon etablerad teori om när β-cellernas funktion börjar försämras i övergången från fetma till diabetes. Vi kan också mäta insulinutsöndringen genom primärodling av bukspottkörteln21 eller ex vivo22. Det kommer dock att förstöra effekten av det centrala nervsystemet på insulinfrisättningen eftersom innervationen av vagusnerven kommer att tas bort. Postabsorberande insulinutsöndring är välkänd, men hjärnan och det autonoma nervsystemet reglerar ocksåinsulinfrisättningen. Experimentet för att analysera det senare bör utföras i en obedövad, ohämmad, smärtfri blodsamling. Det är också därför vagusnerven måste separeras från halspulsådern i steg 2.3.

Diabetes mellitus har rapporterats orsaka hyperglykemi på grund av insulinresistens och ökad utsöndring av glukagon24 och andra motreglerande hormoner25. Dessutom kan upprepade episoder av hypoglykemi hos människor med diabetes på grund av utebliven insulindosering eller andra orsaker leda till ett tillstånd som kallas återkommande hypoglykemi, där patienter är benägna att drabbas av hypoglykemi26. Det har föreslagits att minskningshastigheten i glykemi i hypoglykemisk klämma påverkar perifer eller central detektion av hypoglykemi27. Långsamt insättande hypoglykemi kan vara lämpligt för att studera glukossensorernas roll i portal-mesenteriska vener, medan en mycket snabb sänkning av blodsockret kan vara lämplig för studier av hjärnansglukossensorer. 1 E/ml insulin ges till magra C57BL-möss. Men en högre insulinkoncentration kommer att behövas hos överviktiga möss eftersom de har insulinresistens, och 1 E/ml räcker inte för att sänka blodsockernivåerna.

I enkompartmentmodellen av blodsockerpoolen (Figur 1A) kan mängden absorberad glukos påverka hastigheten på glukostillförseln14. Således kan glukosproduktionshastigheten, ett av huvudmålen för att mäta den hyperinsulinemiska-euglykemiska klämman, påverkas av fastans varaktighet. Lång fastetid kan dock öka frisättningen av motreglerande hormoner. Därför ställer forskare in fastetiden enligt deras analyssyfte. En annan klämmetod inkluderar blodprovstagning från svansen, vilket är enkelt eftersom endast en intravenös kanyl behöver sättas in14. Blod samlas dock i en fasthållning, vilket orsakar en måttlig mängd fasthållningsstress och en ökning av plasmakatekolaminer och andra stresshormoner14. Dessutom är det att föredra att mäta hormonkoncentrationerna i blodflödet i mitten av kroppen snarare än i blodet vid extremiteterna. Därför är blodprovstagning från artärer hos fritt rörliga möss det bästa för att mäta glukosmetabolismen fysiologiskt. Mössen rör sig inte och det behövs ingen vridning när de är acklimatiserade till försöksmiljön. Det rekommenderas dock att använda en svivel för att förhindra att infusions- och provtagningsledningar trasslar in sig. Slang1.2 och slangsats1.4 (Figur 3A) är inte bra för att använda en svivel. Systemet bör förbättras om forskaren måste använda en svivel. Reinfusion av blodkroppar påverkar inte det stabiliserade tillståndet för blodsocker och insulin. Den aktuella metoden kan också tillämpas på metabolomikstudier med hjälp av isotoper. Till exempel, om 13C-glukos kontinuerligt infunderas i venen, kan den systemiska metaboliska omsättningshastigheten och intracellulära intermediära metaboliter mätas28. Detta är alltså en användbar metod för att analysera glukosmetabolismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna redovisar inga motstridiga intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av Leading Initiative for Excellent Young Researchers (från MEXT); Ett bidrag till vetenskaplig forskning (B) (bidrag nr JP21H02352). Japans byrå för medicinsk forskning och utveckling (AMED-RPIME, anslagsnummer JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); Uehara Memorial Foundation; Astellas stiftelse för forskning om metabola sjukdomar; Suzuken Memorial Foundation, Akiyama Life Science Foundation och Narishige Neuroscience Research Foundation. Vi tackar också Nur Farehan Asgar, Ph.D, för att ha redigerat ett utkast av detta manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive glue Henkel AG & Co. KGaA LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide) Morinaga Institute of Bilogical Science Inc M1304 Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 633-03411 LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter Nipro Co. 11-777 Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml) Eli Lilly & Co. 428021014 Humulin R (100U/ml)
Mouse Japan SLC Inc. C57BL/6NCrSlc C57BL
Suture Natsume seisakusho C-23S-560 No.2 Sterilized
Syringe Pump Pump Systems Inc. NE-1000
Synthetic suture VÖMEL HR-17
Tubing1 AS ONE Corporation 9-869-01 LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2 Fisher Scientific 427400 BD Intramedic PE Tubing
Tubing3 IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. size5 Polyethylene tubing size5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
  2. Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
  3. Leanne Riley Mean fasting blood glucose. , World Health Organisation. https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022).
  4. Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
  5. Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
  6. Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
  7. Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
  8. Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
  9. Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330 (2021).
  10. Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
  11. Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141 (2017).
  12. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188 (2011).
  13. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432 (2010).
  14. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  15. DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
  16. Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
  17. Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109 (2015).
  18. Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068 (2022).
  19. Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183 (2019).
  20. Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
  21. Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
  22. Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728 (2021).
  23. Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709 (2022).
  24. Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699 (2019).
  25. Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
  26. Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
  27. Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
  28. TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).

Tags

Medicin nummer 203
Hyperglykemisk klämma och hypoglykemisk klämma hos medvetna möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Abe, T., Toda, C. Hyperglycemic… More

Abe, T., Toda, C. Hyperglycemic Clamp and Hypoglycemic Clamp in Conscious Mice. J. Vis. Exp. (203), e65581, doi:10.3791/65581 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter