Waiting
Traitement de la connexion…

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Hyperglykemisk klemme og hypoglykemisk klemme i bevisste mus

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65581
Automatic Translation
1, 1
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

Summary

En hyperglykemisk klemme brukes til å måle insulinfrigjøring med en opprettholdt høyere blodsukkerkonsentrasjon. En hypoglykemisk klemme er for måling av glukoseproduksjon indusert av motregulerende responser. Begge metodene bruker samme kirurgiske prosedyre. Her presenterer vi en klemmeteknikk for å vurdere systemisk glukosemetabolisme.

Abstract

Diabetes mellitus (DM) skyldes utilstrekkelig insulinfrigjøring fra bukspyttkjertelen β-celler (Type 1 DM) og insulinfølsomhet i muskler, lever og fettvev (Type 2 DM). Insulininjeksjon behandler DM-pasienter, men fører til hypoglykemi som bivirkning. Kortisol og katekolaminer frigjøres for å aktivere glukoseproduksjon fra leveren for å gjenopprette hypoglykemi, kalt motregulerende responser (CRR). I DM-forskning ved hjelp av gnagermodeller brukes glukosetoleransetester og 2-deoksyglukoseinjeksjon til å måle henholdsvis insulinfrigivelse og CRR. Imidlertid endres blodsukkerkonsentrasjonen vedvarende under eksperimenter, noe som forårsaker vanskeligheter med å vurdere netto insulinfrigjøring og CRR. Denne artikkelen beskriver en metode der blodsukkeret holdes på 250 mg / dL eller 50 mg / dL i bevisste mus for å sammenligne frigivelsen av insulin og CRR-hormoner, henholdsvis.

Polyetylenrør er implantert i musens halspulsåre og halsvenen, og musene får lov til å komme seg fra operasjonen. Jugularveneren er koblet til en Hamilton-sprøyte med en sprøytepumpe for å muliggjøre insulin- eller glukoseinfusjon med konstant og variabel hastighet. Den halspulsåren slangen er for blod samling. For den hyperglykemiske klemmen tilføres 30% glukose i venen, og blodsukkernivået måles fra arterielt blod hvert 5. minutt eller 10. minutt. Infusjonshastigheten på 30 % glukose økes til blodglukosenivået blir 250 mg/dl. Blod samles for å måle insulinkonsentrasjoner. Ved hypoglykemisk klemme infunderes 10 mE/kg/min insulin sammen med 30 % glukose, hvis infusjonshastighet er variabel for å opprettholde 50 mg/dl blodglukosenivå. Blod samles for å måle motregulerende hormoner når både glukoseinfusjon og blodsukker når en jevn tilstand. Både hyperglykemiske og hypoglykemiske klemmer har samme kirurgiske prosedyre og eksperimentelle oppsett. Dermed er denne metoden nyttig for forskere av systemisk glukosemetabolisme.

Introduction

Glukose er en viktig energikilde for celler, og mangel på glukose kan føre til en rekke symptomer og komplikasjoner. I tilfelle av lav glukose (hypoglykemi, vanligvis mindre enn 70 mg / dL i fastende blodsukkernivå, men bør ikke bestemmes av en enkelt verdi1), er de vanligste symptomene svakhet, forvirring, svette og hodepine. Det kan også forstyrre hjernefunksjonen og øke risikoen for kardiovaskulære hendelser og dødelighet2. Omvendt er hyperglykemi en medisinsk tilstand der plasmaglukosekonsentrasjonen overstiger normale nivåer (vanligvis > 126 mg / dL i fastende blodsukkernivå3). Dette kan forekomme hos personer med diabetes som enten har et underskudd i insulinproduksjon eller utnyttelse. Hyperglykemi kan føre til diabetisk ketoacidose, som oppstår når kroppen ikke kan bruke glukose til energi, men i stedet bryter ned fettsyrer for drivstoff. Den hyperglykemiske hyperosmolare tilstanden øker også dødeligheten4. Langvarig hyperglykemi kan forårsake skade på blodkar, nerver og organer, noe som fører til utvikling av flere kroniske komplikasjoner som kardiovaskulær sykdom, retinopatier og nyresykdommer. Dermed må blodsukkerkonsentrasjonen opprettholdes i et tett område mellom 100 mg / dL og 120 mg / dL.

Blodsukker reguleres av balansen mellom glukoseinngang og -effekt i en ettromsmodell (figur 1A). Glukoseinngang inkluderer absorbert glukose fra mat og glukoseproduksjon fra lever, nyrer og tynntarm. Glukoseproduksjonen omfatter glukoseopptak i vev og glukoseavhending fra nyrene. Både mengden glukoseinngang og -utgang reguleres av endokrine hormoner. For eksempel frigjøres glukagon, kortikosteron og katekolaminer, kjent som motregulerende hormoner, når blodsukkernivået reduseres5. De stimulerer nedbrytningen av glykogen og syntesen av glukose, hovedsakelig fra leveren; Disse prosessene er kjent som henholdsvis glykogenolyse og glukoneogenese. Hyperglykemi øker insulinfrigjøringen fra bukspyttkjertelen β-celler og stimulerer glukoseopptak i muskler, fettvev og hjerte 6,7,8,9. Trening øker insulinuavhengig glukoseopptak10. Det sympatiske nervesystemet øker glukoseopptaket i muskler og brunt fettvev 6,11. For å måle evnen til å regulere glukosemetabolismen i perifert vev, bruker forskere vanligvis glukosetoleransetesten (GTT) og insulintoleransetesten (ITT) (figur 1B, C). I GTT må to faktorer vurderes: insulinfrigjøring og insulinfølsomhet (figur 1B). Imidlertid er glukosekonsentrasjonskurven under 120 min test forskjellig i hver mus, noe som kan påvirke forskjellige mengder hormonfrigivelse. I ITT reguleres blodsukker av både insulinfølsomhet og frigjøring av motregulerende hormoner. Derfor er det vanskelig å bestemme den nøyaktige betydningen av glukosemetabolisme, insulinfrigjøring og insulinfølsomhet i GTT og ITT, i situasjoner der blodsukkernivået ikke er konstant.

For å overvinne disse problemene, er det ønskelig å holde blodsukkeret på et konstant nivå (eller "klemme"). I hyperglykemisk klemme blir glukose infundert i blodet for å øke blodsukkernivået til et bestemt nivå og deretter opprettholdt på det nivået i en periode. Mengden infundert glukose justeres basert på målinger av blodsukkernivået hvert 5-10 minutt for å opprettholde en jevn tilstand. Denne teknikken er spesielt nyttig for å forstå parametrene for insulinsekresjon ved et klemt glukosenivå. Hypoglykemisk klemme er en metode for å opprettholde lave blodsukkernivåer ved infusjon av insulin. Glukose tilføres med variabel hastighet for å opprettholde et spesifikt blodsukkernivå. Hvis musen ikke kan gjenopprette fra hypoglykemi, bør mer glukose infunderes.

Selv om det er mange fordeler med å utføre hyperglykemiske og hypoglykemiske klemmer, anses de kirurgiske og eksperimentelle prosedyrene som teknisk vanskelige. Dermed har få forskningsgrupper vært i stand til å gjøre dem. Vi hadde som mål å beskrive disse metodene for forskere med økonomiske og arbeidsstyrkebegrensninger for å starte disse eksperimentene på et lavere budsjett.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Kumamoto University.

MERK: For smertelindring ble ibuprofen gitt i drikkevann (0,11 mg / ml) i 48 timer, og buprenorfin (0,05-0,1 mg / kg i.p.) ble gitt 30 minutter før operasjonen. Sterile forhold inkluderer hansker, masker og autoklaverte instrumenter sterilisert med etylenoksid mellom dyr. Operasjonen ble utført på en varmepute satt til 37 °C og dekket av en ny laboratoriematte for hvert dyr. Før operasjonen ble operasjonsområdet rengjort med betadinoppløsning og alkohol. Alle kirurgiske instrumenter ble sterilisert med en autoklav (for ikke mer enn to operasjoner). Før snittet ble gjort, ble mus sjekket for å sikre at de var fullt bedøvet. Anestesidybden for hver mus ble vurdert før og under operasjonen ved hjelp av en tåklemme. Akklimatiseringsperioden var ikke mer enn 5 min hver gang. Følg instruksjonene fra IACUC ved den respektive institusjonen.

1. Forberedelse av slanger for halsvenen og halspulsåren

  1. Steriliser alle slanger, polypropylenforsyninger (f.eks. pipetspisser) og suturer med en autoklav eller etylenoksid. For halsvenen, koble til 8 cm slange1 (se Materialer) og 3 cm slange2 med lim (figur 2A). Sett 2 mm slange1 på toppen fordi slange 2 (polyetylen) er for hard og kan skade blodårene (slange1.1).
  2. Forlengelsesrør for halsvenen (Tubing1.2) for å infundere glukose og insulin
    1. Klargjør to 30 cm rør og ett 10 cm rør med slange2 (figur 2A). Klipp av den skarpe enden av en 20 μL pipettespiss (eller noe som har en smal spissende med OD < 0,5 mm for å koble til slange 1,1) og plasser tre rør2 (30 cm, 30 cm og 10 cm) sammen i den. Forsegling med lim.
    2. Plasser 5 cm slange1 i den andre enden av slangen2.
  3. For halspulsåren (Tubing1.3): Stretch tubing2 for å gjøre den tynnere. Koble sammen 8 cm slange1 og 3 cm av det strukkede slangen2 med lim (figur 2A). Lag et merke på 9 mm fra spissen.
  4. Nål med uskarp ende som forbinder slangen med sprøyten: Lag en ripe nær den skarpe enden av nålen (23 G) med en metallfil, bøy den forsiktig frem og tilbake et par ganger med tangen og knekk den. Gjør det samme kuttet i midten av nålen for å lage et stykke metallkobling (figur 2A).
  5. Forlengelsesrør for arterien for å trekke blod (Slangesett1.4): Koble 10 cm slange1 til metallkoblingen og den uskarpe nålen som ble laget i trinn 1.4.
    MERK: Alle slanger og suturer steriliseres med en autoklav eller etylenoksid

2. Kirurgi

  1. Bedøv mus med isofluran (1,5-2,0%) eller ketamin / xylazin (ketamin 10 mg / ml, xylazin 1 mg / ml i 0,9% sterilt saltvann, 0,1 ml / 10 g kroppsvekt (BW) via intraperitoneal [ip] injeksjon). Hold musen på den varme puten (37 °C) for å redusere fysisk stress. Vent på dypbedøvelse i 5-10 minutter. Bekreft dybden av anestesi ved pedalrefleks, respirasjon og hjertefrekvens, og respons på stimuli ved å klemme på tå. Under operasjonen bør kirurgisk tape brukes til å feste neselokket til operasjonsbordet for kontinuerlig innånding av anestesi. Påfør oftalmisk salve i øynene for å forhindre tørrhet under anestesi.
  2. Fyll heparinert saltvann (100 E/ml) i slanger1,1 og 1,3 og koble dem til en 1 ml sprøyte med en uskarp nål (figur 2B). Lukk enden av slangen3 (se Materialfortegnelse) ved å smelte den med loddejern, som skal brukes som lokk for slanger1.1 og slanger1.3.
  3. Barber og tørk det første (interskapulære på baksiden) og andre (nakken foran) snittområdet med tre sykluser med 10% betadin etterfulgt av et preoperativt preparat med steril 70% alkohol. Lag et lite vertikalt midtlinjesnitt 5 mm cephalic til brystbenet, stump dissekere vevet, og utsette arterien. Separat vagusnerven fra arterien. Dette reduserer de negative effektene av å fjerne vagusnerven på glukosemetabolismen.
    MERK: Trinnet fra det ventrale snittet til trinnet der kateteret settes inn i venen og sikres med silkesuturer, utføres under et mikroskop.
  4. Plasser to silkesuturer under arterien. Stopp blodstrømmen ved å binde en sutur tett på kranialsiden (figur 2C-1) og den andre løst på den kaudale siden (figur 2C-2), som er nok til å stoppe blodstrømmen, men nok til å åpne igjen senere. Plasser en sutur til under arterien (figur 2C-3).
  5. Klipp arterien nær figur 2C-1 med fjærsaks og plasser slange1.3 inn i arterien. Lag et løst bånd på både arterien og slangen (figur 2C-3, ikke bind fast. Slangen vil bli satt dypere inn i arterien). Åpne knuten på den kaudale siden (figur 2C-2) for å sette inn røret til 9 mm-merket når knuten i midten (figur 2C-3). Bind alle ligaturer sikkert og skyll med heparinisert sterilt saltvann.
  6. Eksponer høyre vena jugularis fra samme snitt som høyre halspulsåre for halskateteret. Isoler kranialenden og liger den med silkessutur (figur 2D-1, materialfortegnelse). Plasser et annet stykke sutur i den kaudale enden av den eksponerte venen (figur 2D-2). Klipp venen nær merket Figur 2D-1 med fjærsaks.
  7. Sett inn kateteret (ikke for dypt for å forhindre penetrerende kar), bind det og bekreft visuelt at det prøver blod. Skyll med heparinisert sterilt saltvann (0,2 ml) og bekreft visuelt at det ikke er blod igjen i kateteret.
  8. Plasser musen på den nye sterile kirurgiske gardinen for å forhindre infeksjon fra det første såret. Snu musen, tørk med tre sykluser betadin etterfulgt av et preoperativt preparat med steril alkohol, og gjør et lite snitt mellom skulderbladene.
  9. Før en nålholder under huden fra snittet på ryggen til ventralsiden. Klem katetrene med nåleholderen, før dem under huden og ta dem tilbake. Rengjør snittstedet og lukk de ventrale snittene med en syntetisk sutur (diameter 0,15-0,2 mm). Klem venekateteret med mikroserraffinering på snittstedet mellom skulderbladene.
  10. Klipp kateteret 1 cm over klemmen, skyll det med heparinisert saltvann og lukk det med en hette (trinn 2.4). Følg samme prosedyre for arterielt kateter. Lukk dorsalsnittet med en syntetisk sutur (diameter 0,15-0,2 mm).
  11. Plasser musen i et varmt, rent bur (figur 2E). Utfør postoperativ behandling daglig.

3. Gjenoppretting

  1. Enkelthus musen fordi en annen mus kan bite kateteret i gruppehuset.
    1. For å redusere stress ved sosial isolasjon, hold mus med miljøberikelser (f.eks. Husly). Utfør postoperativ behandling daglig. For å lindre smerte, nød og ubehag, gi postoperativ behandling, inkludert analgesi (ibuprofen i drikkevann (0,11 mg / ml).
    2. Observer mus for tegn på infeksjon, som festering, sløvhet eller smerte på snittstedet. De fleste friske mus begynner å gå og mate ca 2 timer etter operasjonen. En hakket holdning, ruffled pels og redusert matinntak kan indikere smerte. Hvis disse tegnene blir observert, må du umiddelbart avlive musene ved å halshugge dem under dyp anestesi eller karbondioksid kvælning.
  2. Blod vil komme inn i kateteret i arterien og danne en blodpropp. For å opprettholde kateterlinjer, fjern blodproppen daglig, følg trinn 3-6.
  3. Fyll en 1 ml sprøyte og 23 G kanyle (ikke skarp ende) med heparinert saltvann (100 E/ml). Bruk et induksjonskammer til å bedøve musen lett med isofluran (1,0%-1,5%). Fjern deretter musen fra kammeret og utfør blodproppfjerning under isoflurananestesi med en nesehette.
  4. Klem slangen for arterien på baksiden av musen med mikroserraffinering, fjern hetten og trekk ut blodet og blodproppene. Skyll kateteret med heparinisert saltvann med en annen 1 ml sprøyte med en 23 G kanyle (uskarp ende) og sett den på igjen. Rengjør venøs linje som arteriell linje i tilfelle av alvorlig koagulering.
  5. Gjør samme prosedyre for å rengjøre kateteret en gang om dagen i 3-5 dager.
  6. Kontroller musens kroppsvekt. Hvis kroppsvekten reduseres med mer enn 10% fra operasjonsdagen, bruk støttende omsorg og prøv å forbedre den normale kroppstilstandspoengsummen, og bruk musen til et annet eksperiment.
    MERK: Vekttapet av dyr var mindre enn 10% i forsøkene i denne studien. Vekttap vil sterkt påvirke systemisk glukosemetabolisme. Det anbefales derfor å vente på kroppsvektgjenoppretting eller fjerne fra klemmeeksperimentet.

4. Sett opp pumpesystemet (for hypoglykemisk klemme)

  1. Tilbered 1 U / ml insulin i 0,1% BSA saltvann, 30% glukose i saltvann og heparinisert saltvann.
  2. Mål musens kroppsvekt. Beregn volumet for 1 E/ml insulin for å få insulinet til å infusere (10 mE/kg/min). Tilsett 1,7 μL/min insulinoppløsning i musene i klemmeeksperimentet. For å lage 300 mikrol insulininfusat er nødvendig volum for 1 E/ml insulin (μL) 2,647 (μL/g) x kroppsvekt (g). Et volum på 300 μL insulininfusat er nok til å fullføre klemmeeksperimentet på 1 mus. Tabell 1 viser et eksempel på å få insulin til å infusere.
  3. Fyll insulininfusat og 30 % glukose i hver Hamilton-sprøyte, koble dem til slange 1,2 og sett sprøyten på sprøytepumpen (figur 3A). Fyll hver oppløsning i slangen 1.2. Fyll saltvann i en 1 ml sprøyte og slangesett 1,4 (figur 2A).
  4. Bedøv musen med isofluran (1,0 %-1,5 %) og koble slangen1.2 til venekateteret og slangesettet1.4 til arteriekateteret (figur 3A). Bruk cellofantape til å holde rørene sammen.
  5. Plasser musen i et tomt 500 ml beger.
    MERK: For hyperglykemisk klemme, bruk saltvann i stedet for 1 E / ml insulin.

5. Hypoglykemisk klemme

  1. Mål blodsukkernivået hvert 5.-10. minutt, som vist i figur 3B, og ta blodprøver for hormonmålinger ved -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min og 120 min. Følg trinn 5.2 for å måle blodsukker.
    MERK: Det er ikke nødvendig å måle blodsukker på alle tidspunkter, men det anbefales å måle det minst hvert 10. minutt. Mål blodsukkeret hvert 5. minutt når nivået og glukoseinfusjonshastigheten ikke er stabil.
  2. Klem den øverste enden av slangesettet1.4 og koble til en ny sprøyte, trekk ut 50 μL blod og legg det i et 1,5 ml rør for vask. Mål blodsukkernivået.
    MERK: Dette er blodet fortynnet av saltoppløsningen i røret på grunn av katetervask etter forrige prøvetaking. Et volum på 50 μL er nok til å erstatte fortynnet blod med rent blod.
  3. Oppbevar fortynnet blod (røde blodlegemer). Vask blodet (~500 μL) med saltvann (se trinn 5.11-5.12) og returner til kroppen for å forhindre hypoksi.
  4. Kateteret er koblet til arterien med høyt blodtrykk, så når klemmen løsnes, vil blodet strømme ut og brukes til å måle glukose med en hendig glukosemåler. Infiser 50 μL saltvann for å holde nok mengde blodvæske.
  5. For blodprøvetaking, trekk ut ytterligere 50 μL blod og legg det i et 1,5 ml rør på is. Infusér 100 μL (50 μL erstatning + 50 μL prøvetaking) saltvann.
  6. Etter 0 min blodsukkermåling starter insulinsprøytepumpen. Infuse først 30 mE/kg/min i bolus i 2 minutter (5,1 μL/min), deretter 10 mE/kg/min (1,7 μL/min) infusjon resten av varigheten.
  7. Mål blodsukkernivået og endre glukoseinfusjonshastigheten hvert 5.-10. minutt i 120 minutter.
  8. Skape en stabil tilstand der glukoseinfusjonshastigheten ikke endres, og blodsukkernivået er 50 mg/dl.
  9. Etter å ha samlet blodprøven ved t = 120 min, fyll et eutanasimiddel inn i halsvenen og samle vev for RNA- eller proteinanalyse.
  10. Sentrifuge blod ved 1000 x g i 5 minutter og måle hormonkonsentrasjon som insulin eller c-peptid ved hjelp av et ELISA-sett i henhold til produsentens protokoll.
  11. For å vaske blod, sentrifuge blodet ved 1000 x g i 3 minutter. Fjern supernatanten, tilsett 500 μL heparinisert saltvann og utfør pipettering.
  12. Gjenta vasken igjen og legg de vaskede røde blodcellene i en 1 ml sprøyte for arterien. Blodcellene vil bli reinfundert automatisk når 50 eller 100 mikrol saltvann infunderes i trinn 5.2 og 5.3. Overvåk hematokrit nøye for å forhindre hypoksi.
    MERK: For blodsukkermåling ble det brukt en kommersiell hendig glukosemåler.

6. Hyperglykemisk klemme

  1. Følg trinnene som hypoglykemisk klemmeteknikk, men uten insulininfusjon og med blodsukker justert til 250-300 mg / dL. Mål blodsukkernivået hvert 5.-10. minutt, som vist i figur 3B, og ta blodprøver for hormonmålinger ved -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min og 120 min.
  2. Koble en ny sprøyte til slangesettet1.4, trekk ut 50 μl blod og legg den i et 1,5 ml rør for vask.
  3. For blodprøvetaking, trekk ut ytterligere 50 μL blod og legg det i et 1,5 ml rør på is. Infusér 100 μL (50 μL erstatning + 50 μL prøvetaking) saltvann.
  4. Etter 0 min blodsukkermåling, start glukosesprøytepumpen. Tilfør først 30 g/kg/min i bolus i 2 minutter (5,1 μL/min), deretter 10 g/kg/min (1,7 μL/min) resten av varigheten.
  5. Mål blodsukkernivået og endre glukoseinfusjonshastigheten hvert 5.-10. minutt i 120 minutter. Lag en jevn tilstand der glukoseinfusjonshastigheten ikke endres, og blodsukkernivået er 250-300 mg / dL, en klemt hyperglykemisk tilstand.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den hypoglykemiske klemmestudien ble utført på hannmus C57BL/6N (8 uker gamle, mer enn 25 g kroppsvekt) 3 timer fastende ved starten av forsøket (figur 4A,B). Det opprinnelige blodsukkernivået var 136 mg/dl (t = -15 min). Hvis det er mindre enn 90 mg / dL, kan det enten være fordi operasjonen ikke gikk bra, eller arterielle kateteret ble satt inn for dypt, eller blodpropper har kommet inn i blodstrømmen. Musetilstanden etter operasjonen påvirker energimetabolismen i musen. Fysiologisk glukosemetabolisme kan ikke måles under dårlige helsetilstander. C57BL er mer utsatt for koagulering etter operasjonen; mus som har høyere kroppsvekt, som FVB eller ICR-mus, er mindre sannsynlig å gå ned i vekt på grunn av koagulasjonsvask etter operasjonen. Dermed er det bedre for nybegynnere å bruke FVB-mus for å øve på klemmeprosedyrer. C57BL-mus krever mer intensivbehandling. 9 mm kateterinnsetting i arterien har ikke gitt oss noen problemer med å samle blod, selv i FVB- og ICR-mus. Det ble startet insulin med t = 0 min, og blodsukkernivået sank (figur 4A). GIR hadde ikke vært stabil mellom t = 0 min og t = 70 min. Deretter ble det en jevn tilstand etter 80 min.

Den hyperglykemiske klemmestudien ble også utført på mannlige C57BL/6N-mus (8 uker gamle, mer enn 25 g BW) 3 timer fastende ved starten av forsøket (figur 4C,D). Etter å ha målt blodsukker og tatt blodprøver ved t = -15 og t = -5 min, ble glukose infundert fra t = 0 min. Blodsukkernivået ble 250 mg/dl ved t = 40 min. Steady state fortsatte fra t = 30 min til slutten.

Figure 1
Figur 1: Regulering av blodsukkernivå. (A) Konseptuelt diagram som illustrerer reguleringen av blodsukker i kroppen. (B,C) Regulering av glukosemetabolismen i (B) glukosetoleransetest (GTT) og (C) insulintoleransetest (ITT). Flere faktorer regulerer blodsukkernivået. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2 Klargjøring av slanger og trinn i operasjonen. (A) Bilder av slanger for halspulsåren og halsvenen. Rørnumre samsvarer med protokolltrinnnumrene. (B) Metode for klargjøring av slangene for kirurgi. (C, D) De nummererte posisjonene der silketrådene er ligert for å sette kateteret inn i (C) arterien og (D) venen. Silketrådenes posisjoner i kranialen (C-(1)) og halesiden av arterien (C-(2)), og en til i midten av dem (C-(3)) (prosedyre 2-4). Silketrådenes posisjoner i kranialen (D-(1)) og kaudalsiden av venen (D-(2)), og en til i midten av dem (D-(3)) (prosedyre 2-6). (E) Diagram over arterielle og venøse kanyler som går ut av ryggen Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Innstilling av klemmen. (A) Diagram som viser oppsettet av slanger, pumper, sprøyter og musen. (B) Ark for å registrere blodsukkernivåer og glukoseinfusjonshastighet. 50 μL blod samles ved t = -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min og 120 min. Insulininfusjonshastigheten var 5,1 μl/min fra t = 0 til 2 min og endret til 1,7 ved t = 2 min. Blodsukkernivået ble målt hvert 10. Blodsukkeret ble målt hvert 5. minutt når nivået ikke var stabilt. Glukoseinfusjonshastigheten ble endret hver gang blodglukose ble målt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative resultater av hypoglykemisk klemme og hyperglykemisk klemme. (A) Blodsukkernivåer og (B) glukoseinfusjonshastighet for hypoglykemisk klemme. (C) Blodsukkernivåer og (D) glukoseinfusjonshastighet for den hyperglykemiske klemmen. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Løsning Beregning For 20 g mus
1 E/ml insulin (2,647 x kroppsvekt) μL 52,9 μL
0,1% BSA saltvann 300 μL - volum insulin (μL) 247,1 μL

Tabell 1: Et eksempel på beregning for fremstilling av insulininfusat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoden beskrevet her er enkel og kan gjøres med pipettespisser, sprøyter og andre gjenstander som finnes i vanlige laboratorier. Selv om forskere kanskje trenger å kjøpe ekstra rør og pumper, er dyrt utstyr ikke nødvendig. Dermed er denne protokollen for kateterisering og klemme lettere å starte sammenlignet med tidligere rapporter 12,13,14.

Klemmeteknikken ble utviklet rundt 1970 og har blitt brukt på mus og mennesker15. Det er en nyttig metode for nøyaktig måling av glukosemetabolismen og sies å være gullstandarden. Det er imidlertid ikke en vanlig teknikk som brukes av mange forskere. Den hyperinsulinemiske-euglykemiske klemmeteknikken har blitt rapportert hos mus13 og rotter14, men metoden for kateterisering her er annerledes, og leserne kan velge den enklere for sine eksperimenter. Et av formålene med denne artikkelen er å redusere hindringen for å starte et eksperiment. Derfor ga vi detaljert informasjon om materialene til håndlagde katetre, kirurgiske prosedyrer og et eksempel på eksperimentelt tidsforløp. Disse er informative for forskeren som forsøker å utføre klemme i første gang.

Insulinutskillelse ved fedme og diabetes er stadieavhengig. Mange rapporter tyder på at insulinsekresjon økes i fedme for å redusere blodsukkeret i insulinresistent tilstand16, men β-cellefunksjonen vil bli skadet i type 2 DM17,18. Faktisk har antallet og arealet av bukspyttkjerteløyer og insulinsekresjon blitt rapportert å være økt i fedmemusemodeller, for eksempel mus matet med et fettfattig diett19 eller leptinmangelmus20. I disse musemodellene, som har en åpenbar fenotype, kan forskjeller bestemmes ved å undersøke blodinsulinnivået 15-30 minutter etter glukoseadministrasjon i GTT. Imidlertid er det i noen tilfeller ikke lett å bestemme forskjellene i insulinutskillelse. For eksempel, hvis transgene (Tg) mus har et blodsukkernivå på 500 mg / dL mens en WT-mus har 300 mg / dL og begge musene har samme blodinsulinnivå, kan vi si at insulinutskillelsen reduseres i Tg? I dette tilfellet kan vi ikke sammenligne insulinsekresjonsevnen med mindre blodsukkernivået er det samme ved hjelp av metoden som er introdusert her. Dette er en av grunnene til at det ikke finnes etablert teori om når β-cellefunksjonen begynner å svekkes i overgangen fra fedme til diabetes. Vi kan også måle insulinutskillelse ved primærkultur av bukspyttkjertelen21 eller ex vivo22. Det vil imidlertid ødelegge effekten av sentralnervesystemet på insulinfrigjøring fordi innerveringen av vagusnerven vil bli fjernet. Postabsorberende insulinsekresjon er velkjent, men hjernen og det autonome nervesystemet regulerer også insulinfrigjøring23. Forsøket for å analysere sistnevnte skal utføres i en ubedøvet, uhemmet, smertefri blodsamling. Dette er også grunnen til at vagusnerven må skilles fra halspulsåren i trinn 2.3.

Diabetes mellitus har blitt rapportert å forårsake hyperglykemi på grunn av insulinresistens og økte sekreter av glukagon24 og andre motregulerende hormoner25. I tillegg kan gjentatte episoder av hypoglykemi hos mennesker med diabetes på grunn av svikt i insulindosering eller andre årsaker føre til en tilstand som kalles tilbakevendende hypoglykemi, der pasienter er utsatt for hypoglykemi26. Det har blitt foreslått at fallhastigheten i glykemi i hypoglykemisk klemme påvirker perifer eller sentral deteksjon av hypoglykemi27. Langsom hypoglykemi kan være aktuelt for å studere glukosesensorenes rolle i portal-mesenteriske vener, mens en svært rask reduksjon i blodsukker kan være for studier av hjerneglukosesensorer27. 1 E/ml insulin brukes i magre C57BL-mus. Men en høyere insulinkonsentrasjon vil være nødvendig hos overvektige mus fordi de har insulinresistens, og 1 U / ml er ikke nok til å redusere blodsukkernivået.

I ettromsmodellen av blodsukkerbassenget (figur 1A) kan mengden absorbert glukose påvirke hastigheten på glukoseinngangen14. Dermed kan frekvensen av glukoseproduksjon, et av hovedmålene med å måle den hyperinsulinemiske-euglykemiske klemmen, påvirkes av fastevarigheten. Imidlertid kan lang fastetid øke frigivelsen av motregulerende hormoner. Derfor setter forskerne fastetid i henhold til deres analyseformål. En annen klemmemetode inkluderer blodprøvetaking fra halen, noe som er enkelt fordi bare en intravenøs kanyle må settes inn14. Imidlertid samles blod i en fastholdelse, noe som forårsaker en moderat mengde fastholdelsesstress og en økning i plasmakatekolaminer og andre stresshormoner14. I tillegg er det å foretrekke å måle hormonkonsentrasjoner i blodstrømmen i midten av kroppen i stedet for i blodet i ekstremiteter. Derfor er blodprøvetaking fra arterier i frittgående mus det beste for å måle glukosemetabolismen fysiologisk. Musene beveger seg ikke rundt, og svivel er ikke nødvendig når de er akklimatisert til det eksperimentelle miljøet. Det anbefales imidlertid å bruke en svivel for å forhindre innblanding i infusjons- og prøvetakingslinjer. Rør 1.2 og slangesett1.4 (figur 3A) er ikke bra for bruk av svivel. Systemet bør forbedres hvis forskeren må bruke svivel. Reinfusjon av blodceller påvirker ikke den etablerte steady state av blodsukker og insulin. Den nåværende metoden kan også brukes på metabolomics-studier ved bruk av isotoper. For eksempel, hvis 13C-glukose kontinuerlig infunderes i venen, kan den systemiske metabolske omsetningshastigheten og intracellulære mellomliggende metabolitter måles28. Dermed er dette en nyttig metode for å analysere glukosemetabolismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Leading Initiative for Excellent Young Researchers (fra MEXT); et stipend til vitenskapelig forskning (b) (tilskuddsnummer JP21H02352), Japan Agency for medisinsk forskning og utvikling (AMED-RPIME, tilskuddsnummer JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); Uehara Memorial Foundation; Astellas Foundation for forskning på metabolske forstyrrelser; Suzuken Memorial Foundation, Akiyama Life Science Foundation og Narishige Neuroscience Research Foundation. Vi takker også Nur Farehan Asgar, Ph.D., for redigering av et utkast til dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive glue Henkel AG & Co. KGaA LOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide) Morinaga Institute of Bilogical Science Inc M1304 Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insulin) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 633-03411 LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handy glucose meter Nipro Co. 11-777 Free Style Freedom Lite
Insulin (100U/ml) Eli Lilly & Co. 428021014 Humulin R (100U/ml)
Mouse Japan SLC Inc. C57BL/6NCrSlc C57BL
Suture Natsume seisakusho C-23S-560 No.2 Sterilized
Syringe Pump Pump Systems Inc. NE-1000
Synthetic suture VÖMEL HR-17
Tubing1 AS ONE Corporation 9-869-01 LABORAN(R) Silicone Tube
Tubing2 Fisher Scientific 427400 BD Intramedic PE Tubing
Tubing3 IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD. size5 Polyethylene tubing size5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
  2. Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
  3. Leanne Riley Mean fasting blood glucose. , World Health Organisation. https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022).
  4. Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
  5. Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
  6. Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
  7. Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
  8. Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
  9. Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330 (2021).
  10. Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
  11. Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141 (2017).
  12. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188 (2011).
  13. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432 (2010).
  14. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  15. DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
  16. Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
  17. Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109 (2015).
  18. Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068 (2022).
  19. Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183 (2019).
  20. Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
  21. Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
  22. Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728 (2021).
  23. Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709 (2022).
  24. Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699 (2019).
  25. Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
  26. Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
  27. Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
  28. TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).

Tags

Medisin utgave 203
Hyperglykemisk klemme og hypoglykemisk klemme i bevisste mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Abe, T., Toda, C. Hyperglycemic… More

Abe, T., Toda, C. Hyperglycemic Clamp and Hypoglycemic Clamp in Conscious Mice. J. Vis. Exp. (203), e65581, doi:10.3791/65581 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter