Summary
Denne protokollen beskriver en rekonfigurerbar membranbasert cellekulturplattform som integrerer det åpne brønnformatet med væskestrømningsfunksjoner. Denne plattformen er kompatibel med standardprotokoller og muliggjør reversible overganger mellom åpen brønn og mikrofluidisk kulturmodus, imøtekomme behovene til både ingeniør- og biovitenskapslaboratorier.
Abstract
Mikrofysiologiske systemer er miniatyriserte cellekulturplattformer som brukes til å etterligne strukturen og funksjonen til humant vev i en laboratorieinnstilling. Imidlertid har disse plattformene ikke fått utbredt adopsjon i biovitenskapslaboratorier der åpne brønner, membranbaserte tilnærminger tjener som gullstandarden for etterligning av vevsbarrierer, til tross for manglende væskestrømningsfunksjoner. Dette problemet kan primært tilskrives inkompatibiliteten til eksisterende mikrofysiologiske systemer med standardprotokoller og verktøy utviklet for åpne brønnsystemer.
Her presenterer vi en protokoll for å skape en rekonfigurerbar membranbasert plattform med en åpen brønnstruktur, strømningsforbedringsevne og kompatibilitet med konvensjonelle protokoller. Dette systemet benytter en magnetisk monteringstilnærming som muliggjør reversibel veksling mellom åpen brønn og mikrofluidisk modus. Med denne fremgangsmåten har brukerne fleksibilitet til å starte et eksperiment i åpent brønnformat ved hjelp av standardprotokoller og legge til eller fjerne flytfunksjoner etter behov. For å demonstrere den praktiske bruken av dette systemet og dets kompatibilitet med standardteknikker, ble et endotelcellemonolag etablert i et åpent brønnformat. Systemet ble rekonfigurert for å introdusere væskestrøm og deretter byttet til åpent brønnformat for å utføre immunfarging og RNA-ekstraksjon. På grunn av sin kompatibilitet med konvensjonelle åpne brønnprotokoller og strømningsforbedringsevne, forventes denne rekonfigurerbare designen å bli tatt i bruk av både ingeniør- og biovitenskapslaboratorier.
Introduction
Vaskulære barrierer tjener som et kritisk grensesnitt som skiller blodrommet fra det omkringliggende vevet. De spiller en kritisk rolle i å bevare homeostase ved å tiltrekke immunceller, kontrollere molekylær permeabilitet og skjerming mot inntrenging av patogener i vevet 1,2. In vitro dyrkningsmodeller er utviklet for å etterligne in vivo mikromiljøet, noe som muliggjør systematiske undersøkelser av faktorer og forhold som påvirker barriereegenskaper i både friske og syke tilstander 3,4.
Den mest brukte tilnærmingen for slike kulturmodeller er den Transwell-lignende "open-well" -konfigurasjonen5, hvor en porøs, sporetset kulturmembran skiller mediefylte rom (figur 1A). I dette formatet kan celler sås på hver side av membranen, og et bredt spekter av eksperimentelle protokoller er utviklet. Imidlertid er disse systemene begrenset i deres evne til å gi væskestrømmene som er avgjørende for å støtte barrieremodning og etterligne immuncellesirkulasjon sett in vivo 5,6. Følgelig kan de ikke brukes til studier som krever dynamiske strømninger som introduserer legemiddeldoser, mekanisk stimulering eller væskeinduserte skjærspenninger 6,7,8.
For å overvinne begrensningene i åpne brønnsystemer, har mikrofluidiske plattformer som kombinerer porøse kulturmembraner med individuelt adresserbare fluidiske kanaler blitt utviklet9. Disse plattformene gir presis kontroll over væskeruting, perfusjon og innføring av kjemiske forbindelser, kontrollert skjærstimulering og dynamisk celleaddisjonskapasitet 7,10,11,12,13. Til tross for de avanserte mulighetene som tilbys av mikrofluidiske plattformer, har de ikke sett utbredt adopsjon i biovitenskapslaboratorier på grunn av komplekse mikrofluidiske protokoller og deres inkompatibilitet med etablerte eksperimentelle arbeidsflyter 4,10,14.
For å bygge bro over gapet mellom disse teknologiene, presenterer vi en protokoll som bruker et magnetisk rekonfigurerbart, modulbasert system. Dette systemet kan enkelt byttes mellom åpen brønn og mikrofluidisk modus basert på eksperimentets spesifikke behov. Plattformen har en åpen brønn-enhet, kjent som m-μSiM (modulært mikrofysiologisk system aktivert av en silisiummembran), med en 100 nm tykk kulturmembran (nanomembran). Denne nanomembranen har høy porøsitet (15%) og glasslignende gjennomsiktighet, som illustrert i figur 1B. Det skiller fysisk det øverste rommet fra en bunnkanal, noe som muliggjør molekylær transport over fysiologiske lengdeskalaer15. I motsetning til konvensjonelle sporetsede membraner, som har kjente utfordringer i avbildning av levende celler med lysfeltavbildning, muliggjør nanomembranens gunstige optiske og fysiske egenskaper klar visualisering av celler på hver side av membranoverflaten 15,16,17.
Den nåværende protokollen skisserer fabrikasjon av spesialiserte så- og strømningsmoduler og forklarer den magnetiske rekonfigureringen av plattformen. Den demonstrerer hvordan plattformen kan brukes til å etablere endotelbarrierer under både statiske og dynamiske forhold. Denne demonstrasjonen avslører at endotelceller justerer seg langs strømningsretningen, med en oppregulering av skjærfølsomme genmål under skjærstimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne designen kan brukes i forskjellige moduser basert på eksperimentelle krav og sluttbrukerens preferanser. Før hvert eksperiment, konsulter beslutningsflytdiagrammet presentert i figur 2 for å bestemme de nødvendige trinnene og modulene for protokollen. Hvis brukeren for eksempel har til hensikt å opprettholde open well-formatet gjennom et eksperiment for å sammenligne det direkte med Transwell-typesystemet, er mønstersjablongen ikke nødvendig for cellesåing. Kjernemodulen er kommersielt tilgjengelig (se materialfortegnelse), og den ultratynne nanomembranen kan velges fra et bibliotek med materialer med forskjellig porøsitet og porestørrelser for å dekke eksperimentelle behov.
1. Fabrikasjon av mønstersjablongen
MERK: Mønstersjablongen tjener til å plassere celler utelukkende på det porøse området av membranbrikken, og forhindrer celler i å sette seg på det omkringliggende silisiumlaget der de potensielt kan oppleve skade etter at strømningsmodulen er lagt til16 (se figur 3). Skader på monolaget kan påvirke barriereintegriteten negativt og kompromittere eksperimentelle resultater. Sjablongen er unødvendig i en åpen, statisk kultur, da det ikke er fare for skade.
- Kjøp, maskin eller 3D-print en form ved hjelp av designet i tilleggskodefil 1 (figur 4A).
MERK: Sjablongveggene er koniske for å øke mediekapasiteten og minimere bobleoverlapping sammenlignet med funksjoner med rette vegger med høyt sideforhold. - Fest en 130 μm trykkfølsom limfilm (PSA) til en 3,2 mm akrylplate ved hjelp av en kulderulle (se materialfortegnelse).
- Laserkutt akrylarket i henhold til designet gitt i tilleggskodefil 2 for å lage en rekke hulrom (figur 4B).
- Fjern beskyttelseslaget fra PSA-filmen og fest akrylplaten til formen.
MERK: Forsikre deg om at det laserskårne arket er på linje med formen slik at formfunksjonene er sentrert i hulrommet (figur 4C). Nøyaktigheten av celleposisjonering på membranen avhenger av dette trinnet. - Bland PDMS-prepolymeren grundig (ved bruk av et 10: 1-base til katalysatorforhold) (se materialtabellen) og degas den i et vakuumkammer til ingen synlige bobler forblir (5-15 minutter).
- Hell sakte PDMS i formhulrommene, utjevn den med en flat kant.
NOTAT: For å forhindre bobleinnfangning, hell PDMS sakte inn i hvert hulrom. Hvis det er bobler etter helling, plasser formen i vakuumkammeret og avgass den igjen. - Herd PDMS på en kokeplate ved 70 °C i 1 time, og la den avkjøles til romtemperatur.
- Trekk ut sjablongene fra formhulrommene ved hjelp av flattippet pinsett.
2. Fabrikasjon av strømningsmodulen
MERK: Strømningsmodulen deler et lignende fotavtrykk med den kløverformede brønnen til kjernemodulen og inkluderer en støpt mikrokanal (bredde = 1,5 mm, høyde = 0,2 mm, lengde = 5 mm). Kløverformen hjelper til med å justere kanalen over det porøse kulturområdet (figur 5).
- Bruk standard myke litografiteknikker18 til å lage en silisiumform med funksjoner definert av designet i tilleggskodingsfil 3 (figur 4D).
- Fest en 130 μm PSA-film til en 3,2 mm tykk akrylplate.
- Laserkutt akrylarket basert på designet gitt i tilleggskodefil 4 for å lage en rekke kløverformede hulrom (figur 4E).
MERK: Høyden på hulrommet bestemmer høyden på strømningsmodulen, som må være litt høyere (med 0-0,1 mm) enn høyden på kjernemodulbrønnen for å sikre riktig tetting. - Fjern beskyttelseslaget fra PSA-filmen, og fest deretter det laserkuttede arket til silisiumformen ved å justere de trekantede justeringsmerkene på silisiumformen med de på det laserskårne arket.
MERK: I likhet med trinn 1.4 må du sørge for at det laserskårne akrylarket er justert med silisiumformen slik at formfunksjonene er sentrert i hvert hulrom (figur 4F). Dette trinnet bestemmer posisjonen til mikrokanalen i forhold til fotavtrykket. - Hell sakte de avgassede PDMS-ene på formhulrommene og jevn den med en flat kant.
MERK: Hvis det er bobler etter helling, avfett formen til boblene er fjernet. - Legg formen på en kokeplate og stek PDMS ved 70 °C i 1 time, og la formen avkjøles til romtemperatur.
- Fjern strømningsmodulene forsiktig fra formhulrommene ved hjelp av pinsett med flat tipp.
- Orienter strømningsmodulen med mikrokanalfunksjonene vendt oppover, og plasser kjerneinnløps- og utløpsportene på enden av kanalen ved hjelp av en biopsistans (se materialfortegnelse).
3. Fabrikasjon av nedre og øvre akrylhus
MERK: Kjernemodulen passer inn i underhuset. Tiltrekningen mellom innebygde magneter i husene komprimerer og forsegler strømningsmodulen til kjernemodulen (figur 6).
- Laserkutt et 2 mm akrylark ved hjelp av designet som følger med tilleggskodingsfil 5 for å lage det øvre huset med hull for magnetinnsetting.
- Fest en 130 μm PSA-film til en 3,5 mm akrylplate.
- Laserkutt akrylarket basert på designet gitt i tilleggskodefil 6 for å lage det nedre huset med hull for magnetinnsetting.
MERK: Tykkelsen på det nedre huset er en kritisk parameter og må samsvare med den totale tykkelsen på kjernemodulen for å forhindre lekkasje under strømning. - Fjern PSA-beskyttelseslaget og fest underhuset til et glassdeksel.
- Press-fit 4,75 mm nikkelbelagte neodymmagneter (se materialfortegnelse) inn i de laserkuttede hullene i husene.
MERK: Sørg for at magneter i nedre og øvre hus er plassert med motsatt polaritet for å sikre magnetisk tiltrekning (figur 6).
4. Fabrikasjon av strømningskretsen
MERK: Strømningskretsen med lukket sløyfe inneholder to hetteglass med prøveoppsamling som reservoarer (figur 7). Innløpsreservoaret har et polyvinylidendifluorid (PVDF) filter for å tillate cellemediet å likevekte med CO2 -konsentrasjonen i inkubatoren.
- Bruk en 1 mm biopsistans for å lage to hull i hetten på et prøvesamlingshetteglass.
- Bruk biopsistanser til å lage to hull (1 mm og 4 mm) i hetten på et separat prøvetakingsglass, og lag et 1 mm hull i den nedre delen av dette hetteglasset.
- Sett 20 G påføringsspisser inn i hvert av de 1 mm hullene og forsegl dem med varmt lim.
- Plasser et 0,22 μm PVDF-filter (se materialfortegnelse) i 4 mm-hullet og forsegl det med varmt lim.
- Laserkutt et 1,5 mm akrylark ved hjelp av designet i tilleggskodefil 7 for å lage et prøveholdetrinn.
- Plasser reservoarene på akryltrinnet.
- Koble til påføringsspissene ved hjelp av mikrostrømningsrør (se materialfortegnelse).
- Koble rørene til innløpet og utløpet til strømningsmodulen ved hjelp av 21 G påføringsspisser.
- Bruk en peristaltisk pumpe (se Materialfortegnelse) for strømningssirkulasjon.
MERK: Sprøyte- eller pneumatiske pumper kan også brukes til å introdusere strømning om ønskelig. Strømningshastigheten bør bestemmes ut fra eksperimentelle behov. En omfattende tabell, avledet fra en eksperimentelt validert COMSOL-modell, er gitt i tilleggstabell 1 for å hjelpe brukerne med å velge den nødvendige strømningshastigheten for å oppnå ønsket skjærspenning ved cellemonolaget16.
5. Cellesåing
MERK: I likhet med konvensjonelle membraninnsatser kan forskjellige celletyper dyrkes på nanomembranen. En sekundær celletype kan også dyrkes sammen på den andre siden av membranen i bunnkanal15.
- Belegg membranen med 5 μg / cm2 fibronektin (se materialtabell) ved romtemperatur i 1 time for å forbedre cellevedlegget.
MERK: Den valgte celletypen kan påvirke det nødvendige belegget og celletettheten. Prosedyren beskrevet her er for endotelceller i humane navlestrenger (HUVEC, se materialfortegnelse). - Aspirer beleggløsningen ved hjelp av en P200-pipette og plasser en mønstersjablong i kjernemodulbrønnen.
- Legg cellemedier til brønnen og bunnkanalen på enheten.
- Frø HUVECs med en tetthet på 40.000 celler / cm2 inn i brønnen.
MERK: HUVECs ved denne tettheten danner vanligvis et konfluent monolag etter 24 timers inkubasjon16,19. - Legg enheten i en petriskål. Legg en 15 ml konisk rørhette med DI-vann til petriskålen for å opprettholde lokal fuktighet.
- Overfør petriskålen til inkubatoren.
NOTAT: Cellemedier i toppbrønnen og bunnkanalen på enheten skal endres hver 24. Hvis du vil bytte medie i den nederste kanalen, injiserer du forsiktig nye medier i en av portene for å forflytte det gamle mediet fra den andre porten.
6. Konfigurer på nytt til mikrofluidisk modus
- Steriliser det øvre huset, nedre hus, strømningsmodul, reservoarer, rør og dispenseringsspisser ved å plassere dem i et UV-steriliseringskammer i 30 minutter før montering. Sirkuler 70% etanol og deretter steril PBS i strømningskretsen.
- Fyll reservoarene og rørene med endotelcellevekstmedier (se materialfortegnelse).
- Plasser det nedre huset på prøvetrinnet. Sett kjernemodulen med åpen brønn inn i det nedre huset.
- Aspirat cellemedier fra brønnen på modulen. Plasser strømningsmodulen i brønnen.
- Plasser det øvre huset for å forsegle strømningsmodulen i kjernemodulbrønnen. Koble innløps- og utløpsdispenseringsspissene til flytmodulportene.
- Start den peristaltiske pumpen for å introdusere væskestrøm inn i systemet.
7. Gjennomføring av nedstrømsanalyse i åpen brønn-format etter strømningsinnføring
MERK: Kulturtiden her avhenger av de eksperimentelle målene. Brukere kan utføre nedstrømsanalyse (f.eks. Immunocytokjemi, RNA-ekstraksjon) enten i åpne brønn- eller mikrofluidiske formater basert på deres preferanser. For eksempel, hvis et åpent brønnformat foretrekkes, bør systemet konfigureres på nytt for å utføre analyser basert på standardprotokollene16,19.
- Stopp pumpen når ønsket tid for eksponering for skjærstrøm er nådd. Fjern innløps- og utløpstipsene.
- Fjern det øvre huset. Fjern strømningsmodulen forsiktig fra brønnen ved hjelp av pinsett.
- Tilsett 100 μL cellemedier til brønnen. Gjennomføre ønskede analyser basert på standardprotokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den åpne brønnkjernemodulen er opprinnelig plassert i et spesifikt hulrom skapt av et nedre hus og en deksel, som illustrert i figur 6A. Deretter settes strømningsmodulen, som inkluderer en mikrokanal og tilgangsporter, inn i brønnen til kjernemodulen. Strømningsmodulen er forsvarlig forseglet mot silisiumstøttelaget til membranen på grunn av den magnetiske tiltrekningskraften mellom magneter innebygd i nedre og øvre hus, som vist i figur 6B. For å evaluere effektiviteten til denne magnetiske låsemekanismen ble det utført en burst-trykktest som demonstrerte at systemet tåler dødtrykk på opptil 38,8 ± 2,4 kPa. Denne trykktoleransen overskrider betydelig de typiske driftstrykkene som oppstår i cellekulturapplikasjoner. Videre forblir systemet fritt for lekkasjer når det utsettes for strømningshastigheter på opptil 4000 μL/min, noe som tilsvarer en skjærspenning på 74 dynes/cm2 i kulturområdet16.
Når man utvikler en plattform som kan veksle mellom åpen brønn og mikrofluidisk modus, må man nøye vurdere cellesåingsmetoden, som vanligvis ikke er en bekymring for konvensjonelle statiske åpne brønnplattformer16. Skader på monolaget rundt kanalgrensen kan introdusere komplikasjoner i eksperimentelle resultater20. For å løse dette problemet ble det designet en flyttbar sjablong som passer inn i den åpne brønnen til kjernemodulen og gir et spesifikt vindu for celler å bosette seg fortrinnsvis på membranoverflaten (figur 3). Når cellemonolaget er mønstret og når konfluens, har brukeren fleksibilitet til å fortsette eksperimentet i åpent brønnformat eller omkonfigurere plattformen til mikrofluidisk modus for å utsette cellemonolaget for fysiologisk skjærspenning (figur 3). Den magnetiske låsemekanismen gir muligheten til enkelt å bytte mellom åpne brønn- og mikrofluidiske formater etter behov. For eksempel kan enheten gå tilbake til åpent brønnformat etter en strømningsstimulering, noe som gir brukerne fleksibilitet til å utføre en rekke analyser (for eksempel immunfarging, RNA-ekstraksjon og molekylære permeabilitetsmålinger) ved hjelp av standard eksperimentelle protokoller15,16.
I menneskekroppens fysiologiske omgivelser blir den vaskulære barrieren utsatt for strømningsindusert skjærspenning, som tjener som et sentralt biofysisk signal som påvirker strukturen og funksjonen til barrieren 5,21,22. Dermed er tilsetning av væskestrøm i mikrofysiologiske systemer et sentralt krav. For å demonstrere allsidigheten til plattformen ble et HUVEC-monolag etablert i et åpent brønnformat ved hjelp av standardprotokoller. Etter 24 timer med statisk kultur ble plattformen rekonfigurert til mikrofluidisk modus for å eksponere cellemonolaget for 10,7 dynes/cm2 skjærspenning i 24 timer. Resultatene indikerte at celler dyrket under flyt justerte langs strømningsretningen mens celler dyrket uten strømning forble tilfeldig orientert (figur 8A, B). Etter skjærstimulering ble plattformen omkonfigurert til åpent brønnformat for å trekke ut RNA ved hjelp av standardprotokoller. Resultatene indikerte at eksponering av celler for skjærspenning resulterte i oppregulering av Kruppel-lignende faktor 2 (KLF2) og endotelial nitrogenoksidsyntase (eNOS), som tjener kritiske roller som antitrombotiske og ateroprotektive funksjoner i friske blodkar23,24 (figur 8C).
Figur 1: Sammenligning av in vitro vaskulære barrieremodeller. Skjematisk illustrasjon av (A) konvensjonelle Transwell-lignende innsatser og (B) den åpne brønnen m-μSiM. Lysfeltbilder av et konfluent HUVEC-monolag fremhever forskjellen i bildekvalitet for lysfelt mellom en sporetset membran og en ultratynn nanomembran. Skalastenger = 100 μm. Tilpasset fra Mansouri et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Flytskjema for beslutningstaking. Et flytskjema basert på eksperimentelle behov og nedstrøms analysepreferanser. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksperimentell arbeidsflyt av plattformen. (A) For å plassere celler direkte på den porøse membranen, settes en flyttbar mønstersjablong inn i brønnen til kjernemodulen (innsatsen viser mønstrede celler, gule linjer viser mikrokanalgrenser). (B) Sjablongen kan oppbevares eller fjernes i enheten for statisk cellekultur. (C) For å rekonfigurere plattformen til mikrofluidisk modus, erstattes sjablongen med strømningsmodulen. På grunn av den magnetiske tetningsmekanismen er konfigurasjonen reversibel; Hus og strømningsmodulen kan fjernes for å bytte til åpen brønnmodus. Skala bar = 200 μm. Tilpasset fra Mansouri et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Skjematisk illustrasjon av formene. (A) Sjablongformen. (B) Laserskåret akrylplate. (C) samlet visning av sjablongformen. (D) Strømningsmodulform. (E) Laserskåret akrylplate. (F) Montert visning av strømningsmodulformen. Trekantformede funksjoner er justeringsmerker for å lette å feste akrylplater til formene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Skjematisk fremstilling av kløverformet strømningsmodul. (A) Kontaktgrensesnittet mellom strømningsmodulen og membranbrikken. Innløps- og utløpsportene for væskestrøm er vist i rosa. (B) 3D-bilde av PDMS-flytmodulen. Tilpasset fra Mansouri et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Magnetisk montering for rekonfigurering av enheter. (A) Skjematisk demonstrasjon av komponenter for rekonfigurering av enheter i mikrofluidisk modus. Innebygde magneter med motsatte poler induserer tiltrekning for tetningen. (B) Tverrsnittsvisning av den rekonfigurerte enheten som viser vaskulær kanal i rosa og vevsrommet i grønt. Tilpasset fra Mansouri et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Montert visning av strømningskretsen. Kretsen består av en peristaltisk pumpe, to reservoarer for tilførsel av cellemedier og dempingssvingninger, rør og et akryltrinn for å holde komponentene på plass. Tilpasset fra Mansouri et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Sammenligning av HUVEC dyrket i åpen brønn og mikrofluidisk modus. Celler ble sådd og dyrket i åpen brønn i 24 timer for å etablere et konfluent monolag. I løpet av den påfølgende 24-timersperioden ble ett sett med enheter omkonfigurert til mikrofluidisk modus. (A) Celler dyrket under strømning (10,7 dynes.cm-2 skjærspenning) justert langs strømningsretningen (innsatsen viser aktin og kjerner av celler i henholdsvis grønt og blått). (B) Celler dyrket uten strømning i åpent brønnformat viste ingen justering. Lengden på stolper i radarplott viser antall celler i tilsvarende retning. (C) Celler dyrket under flow viste høyere oppregulering av KLF2- og eNOS-gener sammenlignet med ikke-strømningstilstanden (**p < 0,01, n = 3, gjennomsnitt ± SD). Skalastenger = 100 μm. Tilpasset fra Mansouri et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggstabell 1: Skjærspenning på nanomembranoverflaten ved ulike strømningshastigheter. Denne tabellen gir informasjon om skjærspenningsverdier på nanomembranoverflaten ved ulike strømningshastigheter. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 1: CAD-modell av sjablongformen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 2: CAD-modell av laserkuttede hulrom for sjablongformen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 3: CAD-modell av flytmodulen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 4: CAD-modell av laserkuttede hulrom for strømningsmodulformen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 5: CAD-modell av det øvre huset. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 6: CAD-modell av underhuset. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende kodefil 7: CAD-modell av akrylstadiet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Målet med denne protokollen er å utvikle en praktisk metode for å inkorporere strømningsegenskaper i en åpen brønnplattform med en ultratynn nanomembran. I dette designet benyttes en magnetisk låsetilnærming, noe som gjør det mulig å bytte mellom åpen brønn og fluidisk modus under eksperimenter og kombinere fordelene ved begge tilnærmingene. I motsetning til konvensjonelle permanent bundne plattformer, gjør magnetisk låsing at plattformen kan demonteres på praktiske punkter under den eksperimentelle arbeidsflyten 16,25,26,27. I denne plattformen blir celler sådd, og barrieren etableres i det kjente åpne brønnformatet, og deretter blir systemet omkonfigurert til en fluidisk modus ved ganske enkelt å legge til en strømningsmodul og magnetisk forsegle den. Denne rekonfigurasjonen gir to viktige fordeler: For det første muliggjør den simulering av fysiologiske forhold ved å utsette cellemonolaget for væskeindusert skjærspenning; For det andre letter det innføringen av sekundære komponenter som immunceller under strømningsforhold16. Den magnetiske låsefunksjonen tilbyr en verktøyfri monteringsmetode, som muliggjør on-demand bytte mellom åpne brønn- og mikrofluidiske formater. Følgelig kan nedstrømsanalyser, som immuncytokjemi og RNA-ekstraksjon, utføres i det kjente åpne brønnformatet ved hjelp av standardteknikker eller ved bruk av mikrofluidiske teknikker etter ønske16.
Magnetisk tetning er en kritisk parameter i designet som muliggjør omkonfigurerbarhet av plattformen, og det kreves derfor flere hensyn for dens nøyaktige funksjon: (1) Høyden på det nedre huset må samsvare med høyden på kjernemodulen (toleranse: ±0,1 mm) for å omslutte modulen riktig. (2) Høyden på strømningsmodulen må være litt høyere enn brønnen til kjernemodulen (0-0,1 mm). (3) Denne utformingen kan tilpasses et bredt spekter av materialer og krever ikke at strømningsmodulen skal være konstruert av elastomere materialer. Det avgjørende elementet er å innlemme et mykt, pakningslignende materiale i grensesnittet mellom strømningsmodulen og membranbrikken for å etablere en pålitelig tetning. (4) Diameteren på de laserkuttede hulrommene i husene for trykkmonteringsmagneter må optimaliseres basert på instrumentet som brukes28. Magneter kan løsne og føre til strømningslekkasje hvis hulromsdiameteren er for stor, eller hus kan sprekke under magnetinnsetting hvis hulrommene er for små. Ved å følge de nevnte hensynene, kan den magnetiske monteringsmetoden introdusert her brukes til å omkonfigurere andre åpne brønnsystemer til mikrofluidisk modus.
For å ha rekonfigurasjonsevnen er det nødvendig å bruke en mønstersjablong som muliggjør presis posisjonering av celler på membranoverflaten. Sjablongen sikrer at ingen celler er utenfor det porøse kulturområdet (dvs. på silisiumstøtteområdet), som kan bli skadet ved innsetting av strømningsmodulen. Dette aspektet blir spesielt viktig i kokulturmodeller fordi celler utilsiktet sådd på utilsiktede steder ikke kan delta aktivt i utviklingen av barrierevevet. Likevel blir disse feilplasserte cellene vanligvis hentet under lysisprosessen og kan potensielt introdusere skjevhet i genuttrykksstudier som undersøker interaksjoner mellom celler over membranen20. Open-well cellesåing ved hjelp av sjablongen forbedrer såeffektiviteten ved å redusere celletap langs strømningsbanen, som er iboende i konvensjonelle mikrofluidiske plattformer 4,16. Denne plattformen er også i stand til å inkorporere flere celletyper og ECM-materialer 15,16,17. For eksempel kan en cellebelastet hydrogel injiseres i den nedre kanalen av enheten for å etterligne vevsrommet mens et endotel er etablert på toppen av membranen.
Selv om de magnetiske modulene og komponentene kan gjenbrukes, kan det være et problem å opprettholde effektiv tetning over flere bruksområder på grunn av at magneter løsner i huset og reduserer tetningskraften. Dette problemet kan reduseres ved å lage nye laminerte moduler for hvert eksperiment eller masseproduserende komponenter ved hjelp av sprøytestøping eller 3D-utskriftsteknikker når design er etablert. I metoden beskrevet i denne protokollen plasseres flytmodulen manuelt i kjernemodulen, og systemets multipleksings- og automatiseringsevne er begrenset. For å forbedre eksperimentell gjennomstrømning kan strømningsmodulen og det øvre huset integreres i én funksjonell modul som inneholder interne føringskanaler og standardiserte rørforbindelser som samtidig perfuserer flere moduler parallelt.
Komponentene i kjernemodulen med åpen brønn er masseproduserte og kommersielt tilgjengelige. Andre komponenter i systemet, for eksempel strømningsmodulen, husene og mønstersjablongen, kan også fremstilles i stor skala. Videre tillater plattformens rekonfigurerbarhet tillegg av sensorer og aktuatorer (f.eks. transendotelial elektrisk motstandsmodul, elektroporasjonsmodul) for sanntidsstimulering og målinger. Samlet sett kombinerer denne plattformen konvensjonelle og mikrofluidiske tilnærminger for å støtte utbredt bruk utenfor ingeniørlaboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.L.M. er medstifter av SiMPore, Inc. og har en eierandel i selskapet. SiMPore kommersialiserer de ultratynne silisiumbaserte teknologiene, inkludert membranene som brukes i denne studien.
Acknowledgments
Denne forskningen ble delvis finansiert av National Institute of Health under tildelingsnummer R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 og NSF-tilskudd CBET 2150798. Forfatterne takker RIT Machine Shop for aluminiumsformfabrikasjon. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
References
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E.
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).
