Summary
Detta protokoll beskriver en omkonfigurerbar membranbaserad cellodlingsplattform som integrerar formatet med öppen brunn med vätskeflödeskapacitet. Denna plattform är kompatibel med standardprotokoll och möjliggör reversibla övergångar mellan odlingslägen med öppen brunn och mikrofluidik, vilket tillgodoser behoven hos både tekniska och biovetenskapliga laboratorier.
Abstract
Mikrofysiologiska system är miniatyriserade cellodlingsplattformar som används för att efterlikna strukturen och funktionen hos mänskliga vävnader i laboratoriemiljö. Dessa plattformar har dock inte fått någon utbredd användning i biovetenskapliga laboratorier där membranbaserade metoder med öppen brunn fungerar som guldstandard för att efterlikna vävnadsbarriärer, trots att de saknar vätskeflödeskapacitet. Detta problem kan främst hänföras till inkompatibiliteten mellan befintliga mikrofysiologiska system och standardprotokoll och verktyg som utvecklats för öppna brunnssystem.
Här presenterar vi ett protokoll för att skapa en omkonfigurerbar membranbaserad plattform med en öppen brunnsstruktur, flödesförbättringsförmåga och kompatibilitet med konventionella protokoll. Detta system använder en magnetisk monteringsmetod som möjliggör reversibel växling mellan öppen brunn och mikrofluidik. Med den här metoden har användarna flexibiliteten att påbörja ett experiment i formatet med öppen brunn med hjälp av standardprotokoll och lägga till eller ta bort flödesfunktioner efter behov. För att demonstrera den praktiska användningen av detta system och dess kompatibilitet med standardtekniker etablerades ett endotelcellsmonolager i ett öppet brunnsformat. Systemet konfigurerades om för att introducera vätskeflöde och bytte sedan till det öppna brunnsformatet för att utföra immunfärgning och RNA-extraktion. På grund av dess kompatibilitet med konventionella öppna brunnsprotokoll och flödesförbättringsförmåga förväntas denna omkonfigurerbara design att antas av både tekniska och biovetenskapliga laboratorier.
Introduction
Vaskulära barriärer fungerar som ett kritiskt gränssnitt som separerar blodfacket från den omgivande vävnaden. De spelar en avgörande roll för att bevara homeostas genom att attrahera immunceller, kontrollera molekylär permeabilitet och skydda mot intrång av patogener i vävnaden 1,2. In vitro-odlingsmodeller har utvecklats för att efterlikna mikromiljön in vivo, vilket möjliggör systematiska undersökningar av de faktorer och förhållanden som påverkar barriäregenskaper i både friska och sjuka tillstånd 3,4.
Den mest använda metoden för sådana odlingsmodeller är den Transwell-liknande "open-well"-konfigurationen5, där ett poröst, spåretsat odlingsmembran separerar mediefyllda fack (figur 1A). I detta format kan celler sås på vardera sidan av membranet, och ett brett spektrum av experimentella protokoll har utvecklats. Dessa system är dock begränsade i sin förmåga att tillhandahålla de vätskeflöden som är nödvändiga för att stödja barriärmognad och efterlikna immuncellscirkulationen som ses in vivo 5,6. Följaktligen kan de inte användas för studier som kräver dynamiska flöden som introducerar läkemedelsdoser, mekanisk stimulering eller vätskeinducerade skjuvspänningar 6,7,8.
För att övervinna begränsningarna i öppna brunnssystem har mikrofluidikplattformar som kombinerar porösa odlingsmembran med individuellt adresserbara fluidiska kanaler utvecklats9. Dessa plattformar erbjuder exakt kontroll över vätskedirigering, perfusion och införande av kemiska föreningar, kontrollerad skjuvstimulering och dynamiska celladditionsmöjligheter 7,10,11,12,13. Trots de avancerade funktionerna som tillhandahålls av mikrofluidikplattformar har de inte sett någon utbredd användning i biovetenskapliga laboratorier på grund av komplexa mikrofluidiska protokoll och deras inkompatibilitet med etablerade experimentella arbetsflöden 4,10,14.
För att överbrygga gapet mellan dessa tekniker presenterar vi ett protokoll som använder ett magnetiskt omkonfigurerbart, modulbaserat system. Detta system kan enkelt växlas mellan öppen brunn och mikrofluidikläge baserat på experimentets specifika behov. Plattformen har en enhet med öppen brunn, känd som m-μSiM (modulärt mikrofysiologiskt system som möjliggörs av ett kiselmembran), med ett 100 nm tjockt odlingsmembran (nanomembran). Detta nanomembran har hög porositet (15 %) och glasliknande transparens, vilket illustreras i figur 1B. Den separerar fysiskt det övre facket från en nedre kanal, vilket möjliggör molekylär transport över fysiologiska längdskalor15. Till skillnad från konventionella spåretsade membran, som har kända utmaningar med att avbilda levande celler med ljusfältsavbildning, möjliggör nanomembranets gynnsamma optiska och fysikaliska egenskaper tydlig visualisering av celler på vardera sidan av membranytan 15,16,17.
Det nuvarande protokollet beskriver tillverkningen av specialiserade sådd- och flödesmoduler och förklarar den magnetiska omkonfigurationen av plattformen. Den visar hur plattformen kan användas för att etablera endotelbarriärer under både statiska och dynamiska förhållanden. Denna demonstration avslöjar att endotelceller anpassar sig längs flödesriktningen, med en uppreglering av skjuvkänsliga genmål under skjuvstimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna design kan användas i olika lägen baserat på experimentella krav och slutanvändarens preferenser. Före varje experiment, konsultera beslutsflödesschemat som presenteras i figur 2 för att bestämma de nödvändiga stegen och modulerna för protokollet. Om användaren till exempel har för avsikt att behålla formatet med öppen brunn under hela experimentet för att direkt jämföra det med systemet av Transwell-typ, krävs inte mönstringsstencilen för cellsådd. Kärnmodulen är kommersiellt tillgänglig (se Materialförteckning), och det ultratunna nanomembranet kan väljas från ett bibliotek av material med olika porositet och porstorlekar för att passa experimentella behov.
1. Tillverkning av mönsterstencilen
OBS: Mönstringsstencilen tjänar till att placera celler uteslutande på det porösa området av membranchipet, vilket förhindrar att celler sätter sig på det omgivande kiselskiktet där de potentiellt kan uppleva skada efter att flödesmodulen har tillsatts16 (se figur 3). Skador på monolagret kan påverka barriärens integritet negativt och äventyra experimentella resultat. Schablonen är onödig i en öppen, statisk kultur, eftersom det inte finns någon risk för skador.
- Köp, bearbeta eller 3D-skriv ut en form med hjälp av designen som anges i Supplementary Coding File 1 (Figur 4A).
OBS: Stencilväggarna är avsmalnande för att öka mediekapaciteten och minimera bubbelfällning jämfört med raka väggar med högt bildförhållande. - Fäst en 130 μm tryckkänslig självhäftande (PSA) film på en 3.2 mm akrylskiva med en kallrulle (se materialförteckning).
- Laserskära akrylskivan enligt den design som anges i kompletterande kodningsfil 2 för att skapa en matris av hålrum (figur 4B).
- Dra av skyddsskiktet från PSA-filmen och fäst akrylskivan på formen.
OBS: Se till att det laserskurna arket är i linje med formen så att formfunktionerna är centrerade i hålrummet (Figur 4C). Noggrannheten i cellpositioneringen på membranet beror på detta steg. - Blanda PDMS-prepolymeren noggrant (med ett 10:1 bas-till-katalysator-förhållande) (se materialtabell) och avgasa den i en vakuumkammare tills inga synliga bubblor återstår (5-15 min).
- Häll långsamt PDMS i formhåligheterna och jämna ut det med en platt kant.
OBS: För att förhindra att bubblor fastnar, häll PDMS långsamt i varje hålrum. Om det finns bubblor efter hällning, placera formen i vakuumkammaren och avgasa den igen. - Härda PDMS på en värmeplatta vid 70 °C i 1 timme och låt det sedan svalna till rumstemperatur.
- Extrahera stencilerna från formhåligheterna med en pincett med platt spets.
2. Tillverkning av flödesmodulen
OBS: Flödesmodulen delar ett liknande fotavtryck med kärnmodulens klöverformade brunn och inkluderar en gjuten mikrokanal (bredd = 1.5 mm, höjd = 0.2 mm, längd = 5 mm). Klöverformen hjälper till att rikta in kanalen över det porösa odlingsområdet (figur 5).
- Använd standardtekniker för mjuk litografi18 för att skapa en silikonform med egenskaper som definieras av designen i Supplementary Coding File 3 (figur 4D).
- Fäst en 130 μm PSA-film på en 3,2 mm tjock akrylskiva.
- Laserskära akrylskivan baserat på den design som anges i kompletterande kodningsfil 4 för att skapa en rad klöverformade håligheter (figur 4E).
OBS: Höjden på kaviteten bestämmer höjden på flödesmodulen, som måste vara något högre (med 0-0.1 mm) än höjden på kärnmodulbrunnen för att säkerställa korrekt tätning. - Ta bort skyddsskiktet från PSA-filmen och fäst sedan det laserskurna arket på silikonformen genom att rikta in de triangulära inriktningsmärkena på silikonformen med de på det laserskurna arket.
OBS: I likhet med steg 1.4, se till att den laserskurna akrylplåten är i linje med silikonformen så att formens funktioner är centrerade i varje hålrum (Figur 4F). Detta steg bestämmer mikrokanalens position i förhållande till fotavtrycket. - Häll långsamt den avgasade PDMS:en på formhåligheterna och jämna ut den med en platt kant.
OBS: Om det finns bubblor efter hällning, avgasa formen tills bubblorna har tagits bort. - Lägg formen på en kokplatta och grädda PDMS vid 70 °C i 1 timme, låt sedan formen svalna till rumstemperatur.
- Ta försiktigt bort flödesmodulerna från formhåligheterna med en pincett med platt spets.
- Rikta flödesmodulen med mikrokanalfunktionerna vända uppåt och placera kärninlopps- och utloppsportarna i slutet av kanalen med hjälp av en biopsistans (se materialförteckning).
3. Tillverkning av nedre och övre akrylhöljen
OBS: Kärnmodulen passar in i det nedre huset. Attraktionen mellan inbäddade magneter i höljena komprimerar och tätar flödesmodulen till kärnmodulen (figur 6).
- Laserskuren en 2 mm akrylskiva med hjälp av designen i kompletterande kodningsfil 5 för att skapa det övre höljet med hål för magnetinsättning.
- Fäst en 130 μm PSA-film på en 3,5 mm akrylskiva.
- Laserskuren akrylskivan baserat på designen som anges i Supplementary Coding File 6 för att skapa det nedre höljet med hål för magnetinsättning.
OBS: Tjockleken på det nedre höljet är en kritisk parameter och måste matcha den totala tjockleken på kärnmodulen för att förhindra läckage under flödet. - Ta bort PSA-skyddsskiktet och fäst det nedre höljet på ett glastäcke.
- Pressa in 4,75 mm nickelpläterade neodymmagneter (se materialförteckning) i de laserskurna hålen i höljena.
OBS: Se till att magneterna i de nedre och övre höljena är placerade med motsatt polaritet för att säkerställa magnetisk attraktion (Figur 6).
4. Tillverkning av flödeskretsen
OBS: Den slutna flödeskretsen innehåller två sample uppsamlingsflaskor som reservoarer (Figur 7). Inloppsbehållaren har ett polyvinylidendifluoridfilter (PVDF) för att tillåta cellmediet att komma i jämvikt med CO2 -koncentrationen i inkubatorn.
- Använd en 1 mm biopsistans för att skapa två hål i locket på en provflaska.
- Använd biopsistansar för att skapa två hål (1 mm och 4 mm) i locket på en separat provtagningsflaska och skapa ett hål på 1 mm i den nedre delen av denna flaska.
- Sätt in 20 G doseringsspetsar i vart och ett av 1 mm-hålen och försegla dem med varmt lim.
- Placera ett 0.22 μm PVDF-filter (se materialtabell) i 4 mm hålet och försegla det med varmt lim.
- Laserskuren en 1.5 mm akrylskiva med hjälp av designen i Supplementary Coding File 7 för att skapa ett provhållande steg.
- Placera behållarna på akrylscenen.
- Anslut utmatningsspetsarna med mikroflödesrör (se materialförteckning).
- Koppla rören till flödesmodulens inlopp och utlopp med 21 G utmatningsspetsar.
- Använd en peristaltisk pump (se materialförteckning) för flödescirkulation.
OBS: Sprutor eller pneumatiska pumpar kan också användas för att införa flöde om så önskas. Flödeshastigheten bör bestämmas utifrån experimentella behov. En omfattande tabell, härledd från en experimentellt validerad COMSOL-modell, finns i tilläggstabell 1 för att hjälpa användare att välja den nödvändiga flödeshastigheten för att uppnå önskad skjuvspänning vid cellmonolagret16.
5. Sådd av celler
OBS: I likhet med konventionella membraninsatser kan olika celltyper odlas på nanomembranet. En sekundär celltyp kan också samodlas på andra sidan membranet i den nedre kanalen15.
- Täck membranet med 5 μg/cm2 fibronektin (se materialtabell) vid rumstemperatur i 1 timme för att förbättra cellfästet.
OBS: Den valda celltypen kan påverka den erforderliga beläggningen och celldensiteten. Proceduren som beskrivs här är för humana endotelceller i navelvenen (HUVEC, se materialförteckning). - Aspirera beläggningslösningen med en P200-pipett och placera en mönstrad stencil i kärnmodulbrunnen.
- Lägg till cellmedia i brunnen och den nedre kanalen på enheten.
- Sådd HUVECs med en densitet av 40 000 celler/cm2 i brunnen.
OBS: HUVECs med denna densitet bildar vanligtvis ett sammanflytande monolager efter 24 timmars inkubation16,19. - Placera enheten i en petriskål. Tillsätt ett 15 ml koniskt rörlock med DI-vatten i petriskålen för att bibehålla den lokala luftfuktigheten.
- Överför petriskålen till inkubatorn.
OBS: Cellmedia i enhetens övre brunn och nedre kanal bör bytas var 24:e timme. Om du vill byta material i den nedre kanalen injicerar du försiktigt nytt material i en av portarna för att förskjuta det gamla mediet från den andra porten.
6. Omkonfigurering till mikrofluidiskt läge
- Sterilisera det övre huset, det nedre huset, flödesmodulen, reservoarerna, rören och dispenseringsspetsarna genom att placera dem i en UV-steriliseringskammare i 30 minuter före montering. Cirkulera 70% etanol och sedan steril PBS i flödeskretsen.
- Fyll reservoarerna och rören med endotelcellstillväxtmedia (se materialförteckning).
- Placera det nedre höljet på sample stage. Sätt in kärnmodulen med öppen brunn i det nedre huset.
- Aspirera cellmedia från modulens brunn. Placera flödesmodulen i brunnen.
- Placera det övre höljet för att täta flödesmodulen i kärnmodulbrunnen. Anslut inlopps- och utloppsutmatningsspetsarna till flödesmodulportarna.
- Starta den peristaltiska pumpen för att införa vätskeflöde i systemet.
7. Genomförande av nedströmsanalys i form av öppna brunnar efter flödesintroduktion
OBS: Kulturtiden här beror på de experimentella målen. Användare kan utföra nedströmsanalys (t.ex. immunocytokemi, RNA-extraktion) antingen i öppen brunn eller mikrofluidiska format baserat på deras önskemål. Till exempel, om ett format med öppen brunn är att föredra, bör systemet konfigureras om för att utföra analyser baserade på standardprotokoll16,19.
- Stoppa pumpen när önskad tid för skjuvflödesexponering har uppnåtts. Ta bort inlopps- och utloppsutmatningsspetsarna.
- Ta bort det övre höljet. Ta försiktigt bort flödesmodulen från brunnen med en pincett.
- Tillsätt 100 μL cellmedia till brunnen. Utför önskade analyser baserade på standardprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kärnmodulen med öppen brunn är initialt placerad i ett specifikt hålrum som skapas av ett lägre hölje och en täckglas, som illustreras i figur 6A. Därefter sätts flödesmodulen, som inkluderar en mikrokanal och åtkomstportar, in i kärnmodulens brunn. Flödesmodulen är säkert förseglad mot membranets silikonstödskikt på grund av den magnetiska attraktionskraften mellan magneter inbäddade i de nedre och övre höljena, som visas i figur 6B. För att utvärdera effektiviteten hos denna magnetiska låsmekanism utfördes ett sprängtryckstest som visade att systemet kan motstå återvändsgränder på upp till 38,8 ± 2,4 kPa. Denna trycktolerans överstiger avsevärt de typiska driftstryck som förekommer i cellodlingsapplikationer. Dessutom förblir systemet fritt från läckage när det utsätts för flöden på upp till 4000 μL/min, vilket motsvarar en skjuvspänning på 74 dyner/cm2 i odlingsområdet16.
Vid utveckling av en plattform som kan växla mellan öppen brunn och mikrofluidisk metod måste man noga överväga cellsåddsmetoden, vilket vanligtvis inte är ett problem för konventionella statiska plattformar med öppen brunn16. Skador på monolagret runt kanalgränsen kan leda till komplikationer i experimentella resultat20. För att lösa detta problem designades en avtagbar stencil som passar i kärnmodulens öppna brunn och ger ett specifikt fönster för celler att sätta sig företrädesvis på membranytan (figur 3). När cellmonolagret är mönstrat och når sammanflöde har användaren flexibiliteten att fortsätta experimentet i formatet med öppen brunn eller konfigurera om plattformen till mikrofluidiskt läge för att exponera cellmonolagret för fysiologisk skjuvspänning (figur 3). Den magnetiska låsmekanismen gör det möjligt att enkelt växla mellan den öppna brunnen och mikrofluidiska format efter behov. Till exempel kan enheten återgå till formatet med öppen brunn efter en flödesstimulering, vilket ger användarna flexibiliteten att utföra en mängd olika analyser (såsom immunfärgning, RNA-extraktion och molekylära permeabilitetsmätningar) med hjälp av standardexperimentella protokoll15,16.
I människokroppens fysiologiska miljö utsätts den vaskulära barriären för flödesinducerad skjuvspänning, vilket fungerar som en viktig biofysisk signal som påverkar barriärens struktur och funktion 5,21,22. Således är tillsatsen av vätskeflöde i mikrofysiologiska system ett nyckelkrav. För att demonstrera plattformens mångsidighet etablerades ett HUVEC-monolager i ett öppet brunnsformat med hjälp av standardprotokoll. Efter 24 timmars statisk odling konfigurerades plattformen om till mikrofluidiskt läge för att exponera cellens monolager för 10,7 dyner/cm2 skjuvspänning i 24 timmar. Resultaten indikerade att celler som odlats under flöde i linje med flödesriktningen medan celler som odlats utan flöde förblev slumpmässigt orienterade (Figur 8A,B). Efter skjuvstimulering konfigurerades plattformen om till open-well-formatet för att extrahera RNA med hjälp av standardprotokoll. Resultaten indikerade att cellernas exponering för skjuvspänning resulterade i uppreglering av Kruppel-liknande faktor 2 (KLF2) och endotelial kväveoxidsyntas (eNOS), som har kritiska roller såsom antitrombotiska och aterosrotektiva funktioner i friska blodkärl23,24 (Figur 8C).
Figur 1: Jämförelse av in vitro vaskulära barriärmodeller. Schematisk illustration av (A) konventionella Transwell-liknande insatser och (B) m-μSiM i den öppna brunnen. Ljusfältsbilder av ett sammanflytande HUVEC-monolager belyser skillnaden i ljusfältsbildkvalitet mellan ett spåretsat membran och ett ultratunt nanomembran. Skalstreck = 100 μm. Anpassad från Mansouri et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Flödesschema för beslutsfattande. Ett flödesschema baserat på experimentella behov och preferenser för nedströmsanalys. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Experimentellt arbetsflöde för plattformen. (A) För att direkt positionera celler på det porösa membranet sätts en avtagbar mönstringsstencil in i kärnmodulens brunn (infällningen visar mönstrade celler, gula linjer uppvisar mikrokanalgränser). (B) Stencilen kan behållas eller tas bort i anordningen för statisk cellodling. (C) För att konfigurera om plattformen till mikrofluidiskt läge ersätts stencilen med flödesmodulen. På grund av den magnetiska tätningsmekanismen är konfigurationen reversibel; Husen och flödesmodulen kan tas bort för att växla till öppet brunnsläge. Skalstapel = 200 μm. Anpassad från Mansouri et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Schematisk illustration av formarna. (A) Schablonformen. (B) Laserskuren akrylskiva. (C) monterad vy av stencilformen. (D) Flödesmodul form. (E) Laserskuren akrylskiva. (F) Monterad view av flödesmodulformen. Triangelformade funktioner är inriktningsmärken för att underlätta fästning av akrylskivor på formarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Schematisk bild av den klöverformade flödesmodulen. (A) Kontaktgränssnittet mellan flödesmodulen och membranchipet. Inlopps- och utloppsportarna för vätskeflöde visas i rosa. B) 3D-bild av PDMS-flödesmodulen. Anpassad från Mansouri et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Magnetisk enhet för omkonfigurering av enheten. A) Schematisk demonstration av komponenter för omkonfigurering av enheter till mikrofluidiskt läge. Inbäddade magneter med motsatta poler inducerar attraktion för tätningen. (B) Tvärsnittsbild av den omkonfigurerade anordningen som visar kärlkanalen i rosa och vävnadsfacket i grönt. Anpassad från Mansouri et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Monterad view av flödeskretsen. Kretsen består av en peristaltisk pump, två reservoarer för tillförsel av cellmedia och dämpning av fluktuationer, slangar och ett akrylsteg för att hålla komponenterna på plats. Anpassad från Mansouri et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Jämförelse av HUVECs odlade i öppen brunn och mikrofluidiska lägen. Cellerna såddes och odlades i öppen brunn i 24 timmar för att etablera ett sammanflytande monolager. Under den efterföljande 24-timmarsperioden konfigurerades en uppsättning enheter om till mikrofluidiskt läge. (A) Celler odlade under flöde (10,7 dynes.cm-2 skjuvspänning) i linje med flödesriktningen (den infällda bilden visar aktin och cellkärnor i grönt respektive blått). (B) Celler odlade utan flöde i öppen brunn visade ingen anpassning. Längden på staplarna i radardiagram visar antalet celler i motsvarande riktning. (C) Celler odlade under flöde uppvisade högre uppreglering av KLF2- och eNOS-gener jämfört med no-flow-tillståndet (**p < 0,01, n = 3, medelvärde ± SD). Skalstreck = 100 μm. Anpassad från Mansouri et al.16. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggstabell 1: Skjuvspänning på nanomembranytan vid olika flödeshastigheter. Denna tabell ger information om skjuvspänningsvärden på nanomembranytan vid olika flödeshastigheter. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 1: CAD-modell av stencilformen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 2: CAD-modell av laserskurna håligheter för stencilformen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 3: CAD-modell av flödesmodulen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 4: CAD-modell av laserskurna håligheter för flödesmodulformen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 5: CAD-modell av det övre höljet. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 6: CAD-modell av det nedre huset. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande kodningsfil 7: CAD-modell av akrylsteget. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med detta protokoll är att utveckla en praktisk metod för att införliva flödeskapacitet i en öppen brunnsplattform med ett ultratunt nanomembran. I denna design används en magnetisk låsningsmetod, vilket gör det möjligt att växla mellan öppen brunn och fluidiska lägen under experiment och kombinera fördelarna med båda metoderna. Till skillnad från konventionella permanent bundna plattformar gör magnetisk låsning att plattformen kan demonteras vid lämpliga punkter under det experimentella arbetsflödet 16,25,26,27. I denna plattform sås celler och barriären etableras i det välbekanta formatet med öppen brunn, och sedan konfigureras systemet om till ett fluidiskt läge genom att helt enkelt lägga till en flödesmodul och magnetiskt försegla den. Denna omkonfigurering erbjuder två viktiga fördelar: för det första möjliggör den simulering av fysiologiska förhållanden genom att utsätta cellmonolagret för vätskeinducerad skjuvspänning; För det andra underlättar det införandet av sekundära komponenter som immunceller under flödesförhållanden16. Den magnetiska låsfunktionen erbjuder en verktygsfri monteringsmetod, vilket möjliggör växling på begäran mellan öppna brunnar och mikrofluidiska format. Följaktligen kan nedströmsanalyser, såsom immunocytokemi och RNA-extraktion, utföras i det välbekanta öppna brunnsformatet med hjälp av standardtekniker eller med hjälp av mikrofluidiska tekniker efter önskemål16.
Magnetisk tätning är en kritisk parameter i designen som möjliggör omkonfigurerbarhet av plattformen, och därför krävs flera överväganden för dess exakta funktion: (1) Höjden på det nedre höljet måste matcha höjden på kärnmodulen (tolerans: ±0.1 mm) för att omsluta modulen ordentligt. (2) Flödesmodulens höjd måste vara något högre än kärnmodulens brunn (0-0.1 mm). (3) Denna design är anpassningsbar till ett brett spektrum av material och kräver inte att flödesmodulen är konstruerad av elastomermaterial. Det avgörande elementet är att införliva ett mjukt, packningsliknande material vid gränssnittet mellan flödesmodulen och membranchipet för att skapa en tillförlitlig tätning. (4) Diametern på de laserskurna hålrummen i höljena för presspassningsmagneter måste optimeras baserat på det instrument som används28. Magneter kan lossna och leda till flödesläckage om kavitetsdiametern är för stor, eller höljen kan spricka under magnetinsättning om hålrummen är för små. Genom att följa de ovan nämnda övervägandena kan den magnetiska monteringsmetoden som introduceras här tillämpas för att konfigurera om andra öppna brunnssystem till mikrofluidiskt läge.
För att ha omkonfigurationsförmågan är det nödvändigt att använda en mönstrad stencil som möjliggör exakt positionering av celler på membranytan. Stencilen säkerställer att inga celler finns utanför det porösa odlingsområdet (dvs. på kiselstödsregionen), som kan skadas vid införandet av flödesmodulen. Denna aspekt blir särskilt viktig i samodlingsmodeller eftersom celler som oavsiktligt sås på oavsiktliga platser inte aktivt kan delta i utvecklingen av barriärvävnaden. Icke desto mindre hämtas dessa felplacerade celler vanligtvis under lyseringsprocessen och kan potentiellt introducera bias i genuttrycksstudier som undersöker interaktioner mellan celler över membranet20. Cellsådd med öppen brunn med hjälp av stencilen förbättrar såddeffektiviteten genom att mildra cellförluster längs flödesvägen, som är inneboende i konventionella mikrofluidiska plattformar 4,16. Denna plattform kan också innehålla flera celltyper och ECM-material 15,16,17. Till exempel kan en cellladdad hydrogel injiceras i enhetens nedre kanal för att efterlikna vävnadsfacket medan ett endotel etableras ovanpå membranet.
Även om de magnetiska modulerna och komponenterna kan återanvändas kan det vara ett problem att upprätthålla effektiv tätning under flera användningsområden på grund av att magneterna lossnar i höljet och minskar tätningskraften. Detta problem kan mildras genom att göra nya laminerade moduler för varje experiment eller massproducera komponenter med hjälp av formsprutning eller 3D-utskriftstekniker när designen väl har fastställts. I metoden som beskrivs i detta protokoll placeras flödesmodulen manuellt i kärnmodulen, och systemets multiplexerings- och automatiseringsförmåga är begränsad. För att förbättra den experimentella genomströmningen kan flödesmodulen och det övre höljet integreras i en funktionsmodul som innehåller interna dragningskanaler och standardiserade slanganslutningar som samtidigt genomdriver flera moduler parallellt.
Komponenterna i kärnmodulen med öppen brunn är massproducerade och kommersiellt tillgängliga. Andra komponenter i systemet, såsom flödesmodulen, höljen och mönstringsstencilen, kan också tillverkas i stor skala. Dessutom gör plattformens omkonfigurerbarhet det möjligt att lägga till sensorer och ställdon (t.ex. transendotelial elektrisk motståndsmodul, elektroporeringsmodul) för stimulering och mätningar i realtid. Sammantaget kombinerar denna plattform konventionella och mikrofluidiska metoder för att stödja utbredd användning utanför tekniska laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
J.L.M. är en av grundarna av SiMPore, Inc. och har en aktieandel i företaget. SiMPore kommersialiserar de ultratunna kiselbaserade teknikerna, inklusive de membran som används i denna studie.
Acknowledgments
Denna forskning finansierades delvis av National Institute of Health under tilldelningsnummer R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 och NSF-anslag CBET 2150798. Författarna tackar RIT Machine Shop för tillverkning av aluminiumformar. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis National Institutes of Healths officiella åsikter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
| 1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
| 1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| 20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
| 21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
| 3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
| 3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
| AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
| Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
| Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
| Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
| Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
| Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
| Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
| Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
| Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
| Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
| PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
| Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
| SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
| Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
| Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
| TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
| Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
| uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
| uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |
References
- Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
- Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
- Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
- Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
- Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086 (2022).
- Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
- Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
- Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E.
- Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360 (2019).
- Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
- Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186 (2021).
- Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengineering. 10 (5), 519 (2023).
- McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804 (2022).
- Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802 (2022).
- Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624 (2023).
- Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
- Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769 (2022).
- Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225 (2021).
- Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
- Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
- Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
- Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
- Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341 (2016).
- Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019 (2022).
- Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015 (2018).
- Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457 (2022).
