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Cancer Research

मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री पैराफिन-एम्बेडेड फेफड़े के कैंसर ऊतक के लिए धुंधला हो जाना

Published: November 21, 2023 doi: 10.3791/65850
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Center of Precision Medicine, West China Hospital, Sichuan University, 2Institute of Clinical Pathology, West China Hospital, Sichuan University

Summary

यह प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल एक मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) धुंधला विधि का वर्णन और अनुकूलन करता है, मुख्य रूप से एकल-चैनल एंटीबॉडी इनक्यूबेशन स्थितियों को अनुकूलित करके और नैदानिक मूल के फेफड़ों के कैंसर के ऊतकों में ऑटोफ्लोरेसेंस और चैनल क्रॉसस्टॉक की समस्याओं को हल करने के लिए एंटीबॉडी और चैनलों की सेटिंग्स को समायोजित करके।

Abstract

फेफड़े का कैंसर पूरी दुनिया में घातक ट्यूमर से संबंधित रुग्णता और मृत्यु दर का प्रमुख कारण है, और जटिल ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट को फेफड़ों के कैंसर रोगियों में मृत्यु का प्रमुख कारण माना जाता है। ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट की जटिलता को ट्यूमर के ऊतकों में सेल-टू-सेल संबंधों को समझने के लिए प्रभावी तरीकों की आवश्यकता होती है। मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (एमआईएचसी) तकनीक ट्यूमर के ऊतकों में सिग्नलिंग मार्गों के अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्रोटीन की अभिव्यक्ति और नैदानिक निदान और उपचार योजनाओं को विकसित करने के बीच संबंधों का अनुमान लगाने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बन गई है। एमआईएचसी टायरामाइन सिग्नल एम्प्लीफिकेशन (टीएसए) तकनीक पर आधारित एक मल्टी-लेबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला विधि है, जो एक साथ विभिन्न प्रोटीन सह-अभिव्यक्ति और सह-स्थानीयकरण विश्लेषण प्राप्त करने के लिए एक ही ऊतक अनुभाग नमूने पर कई लक्ष्य अणुओं का पता लगा सकता है। इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में, नैदानिक मूल के फेफड़े स्क्वैमस कार्सिनोमा के पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक वर्गों को मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला के अधीन किया गया था। प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का अनुकूलन करके, लेबल लक्ष्य कोशिकाओं और प्रोटीन के मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला हासिल किया गया था, फेफड़ों के ऊतकों में ऑटोफ्लोरेसेंस और चैनल क्रॉसस्टॉक की समस्या को हल करना। इसके अलावा, मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला व्यापक रूप से ट्यूमर से संबंधित, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के प्रयोगात्मक सत्यापन में उपयोग किया जाता है, जिसमें एकल-कोशिका अनुक्रमण, प्रोटिओमिक्स और ऊतक स्थान अनुक्रमण शामिल हैं, जो सहज और दृश्य विकृति सत्यापन परिणाम प्रदान करते हैं।

Introduction

टायरामाइन सिग्नल प्रवर्धन (टीएसए), जिसका 20 से अधिक वर्षों का इतिहास है, परख तकनीकों का एक वर्ग है जो लक्ष्य एंटीजन के सीटू लेबलिंग में उच्च घनत्व के लिए हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) का उपयोग करता है और एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एएलआईएसए) में व्यापक रूप से लागू होता है, स्वस्थानी संकरण (आईएसएच), इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी), और जैविक एंटीजन का पता लगाने के लिए अन्य तकनीकों, पता लगाए गए सिग्नल की संवेदनशीलता में काफी सुधार1. टीएसए प्रौद्योगिकी पर आधारित ओपल पॉलीक्रोमैटिक धुंधला हाल ही में विकसित किया गया है और व्यापक रूप सेकई अध्ययनों 2,3,4,5में उपयोग किया जाता है। पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस (आईएफ) धुंधला शोधकर्ताओं को विभिन्न मॉडल जीवों की कोशिकाओं और ऊतकों में प्रोटीन के वितरण का पता लगाने और तुलना करने के लिए एक आसान उपकरण प्रदान करता है। यह एंटीबॉडी-/एंटीजन-विशिष्ट बंधन पर आधारित है और इसमें प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष दृष्टिकोणशामिल हैं। प्रत्यक्ष immunostaining ब्याज के प्रतिजन के खिलाफ एक फ्लोरोफोरे-संयुग्मित प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग शामिल है, जो एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट का पता लगाने में सक्षम बनाता है. अप्रत्यक्ष इम्यूनोस्टेनिंग दृष्टिकोण में असंबद्ध प्राथमिक एंटीबॉडी 6,7 के खिलाफ फ्लोरोफोरे-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का आवेदन शामिल है।

पारंपरिक, एकल-लेबल, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना विधियां केवल एक, दो, या कुछ मामलों में, ऊतकों में तीन एंटीजन को दाग सकती हैं, जो ऊतक वर्गों में निहित समृद्ध जानकारी के खनन में एक प्रमुख सीमा है। मात्रात्मक परिणामों की व्याख्या अक्सर इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा दृश्य अवलोकन और सटीक मात्रा का ठहराव पर निर्भर करती है, जैसे कि इमेजजे। तकनीकी सीमाएं हैं, जैसे एंटीबॉडी प्रजातियों पर प्रतिबंध, कमजोर फ्लोरोसेंट लेबल संकेत, और फ्लोरोसेंट डाई रंग ओवरलैप(तालिका 1)। ओपल मल्टीप्लेक्स आईएचसी (एमआईएचसी) तकनीक टीएसए व्युत्पत्ति पर आधारित है, जो मल्टीप्लेक्स धुंधला और एक ही ऊतक अनुभाग पर 7-9 से अधिक एंटीजन के अंतर लेबलिंग की अनुमति देता है, प्राथमिक एंटीबॉडी की उत्पत्ति पर कोई प्रतिबंध नहीं है, लेकिन उच्च विशिष्टता की आवश्यकता होती है एंटीजन के खिलाफ इसी एंटीबॉडी की। धुंधला प्रक्रिया सामान्य इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के समान है, दो अंतरों को छोड़कर: धुंधला होने के प्रत्येक दौर में केवल एक एंटीबॉडी का उपयोग शामिल होता है और एक एंटीबॉडी क्षालन कदम जोड़ा जाता है। गैर-सहसंयोजक बंधों द्वारा एंटीजन से बंधे एंटीबॉडी को माइक्रोवेव क्षालन द्वारा हटाया जा सकता है, लेकिन सहसंयोजक बंधों द्वारा एंटीजन की सतह से बंधे टीएसए फ्लोरोसेंट सिग्नल को बरकरार रखा जाता है।

डाई के साथ लेबल किए गए सक्रिय टाइरामाइन (टी) अणु लक्ष्य प्रतिजन पर अत्यधिक समृद्ध होते हैं, जिससे फ्लोरोसेंट सिग्नल के कुशल प्रवर्धन की अनुमति मिलती है। यह एंटीबॉडी हस्तक्षेप के बिना प्रतिजन के प्रत्यक्ष लेबलिंग की अनुमति देता है, और फिर बहुरंगा लेबलिंग कई धुंधला चक्र 8,9,10(चित्रा 1)के बाद प्राप्त किया जा सकता है. यद्यपि यह तकनीक बीमारी के अध्ययन के लिए विश्वसनीय और सटीक छवियां पैदा करती है, लेकिन एक उपयोगी मल्टीप्लेक्स फ्लोरोसेंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (एमएफआईएचसी) धुंधला रणनीति का निर्माण व्यापक अनुकूलन और डिजाइन की आवश्यकता के कारण समय लेने वाली और सटीक हो सकती है। इसलिए, इस मल्टीप्लेक्स पैनल प्रोटोकॉल मैनुअल प्रोटोकॉल की तुलना में एक कम धुंधला समय के साथ एक स्वचालित आईएचसी स्टेनर में अनुकूलित किया गया है. इस दृष्टिकोण सीधे लागू किया और मानव formalin-तय और पैराफिन एम्बेडेड (एफएफपीई) ऊतक नमूने11 पर इम्यूनो ऑन्कोलॉजी अध्ययन के लिए किसी भी शोधकर्ता द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है. इसके अलावा, स्लाइड तैयारी, एंटीबॉडी अनुकूलन, और मल्टीप्लेक्स डिजाइन के लिए तरीकों मजबूत छवियों है कि सीटू में सटीक सेलुलर बातचीत का प्रतिनिधित्व करते हैं और मैनुअल विश्लेषण12 के लिए अनुकूलन अवधि को छोटा करने में सहायक हो जाएगा.

एमएफआईएचसी में मुख्य रूप से छवि अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण शामिल है। छवि अधिग्रहण के संदर्भ में, बहुरंगा लेबल जटिल दाग नमूनों पेशेवर वर्णक्रमीय इमेजिंग उपकरण के साथ पता लगाया जा करने के लिए विभिन्न मिश्रित रंग संकेतों की पहचान करने और ऊतक autofluorescence से हस्तक्षेप के बिना उच्च संकेत करने के लिए शोर छवियों को प्राप्त करने की जरूरत है. वर्णक्रमीय इमेजिंग के लिए वर्तमान उपकरण में मुख्य रूप से वर्णक्रमीय कन्फोकल माइक्रोस्कोप और मल्टीस्पेक्ट्रल ऊतक इमेजिंग सिस्टम शामिल हैं। मल्टीस्पेक्ट्रल ऊतक इमेजिंग सिस्टम ऊतक वर्गों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए डिज़ाइन किया गया एक पेशेवर इमेजिंग सिस्टम है, और इसकी सबसे महत्वपूर्ण विशेषता छवि वर्णक्रमीय जानकारी का अधिग्रहण है, जो जैविक ऊतक नमूनों 13,14की रूपात्मक संरचना और ऑप्टिकल मैपिंग जानकारी दोनों प्रदान करता है। वर्णक्रमीय छवि में किसी भी पिक्सेल में एक पूर्ण वर्णक्रमीय वक्र होता है, और प्रत्येक डाई (ऑटोफ्लोरेसेंस सहित) में इसकी संबंधित विशेषता स्पेक्ट्रम होता है, जो मिश्रित और अतिव्यापी मल्टीलेबल संकेतों की पूर्ण रिकॉर्डिंग और सटीक पहचान को सक्षम बनाता है।

डेटा विश्लेषण के संदर्भ में, बहुरंगा लेबल नमूने रूपात्मक संरचना और ऊतक नमूनों के घटक कोशिकाओं के कारण बेहद जटिल हैं. साधारण सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से विभिन्न ऊतक प्रकारों की पहचान नहीं कर सकता है। इसलिए, बुद्धिमान मात्रात्मक ऊतक विश्लेषण सॉफ्टवेयर विशिष्ट क्षेत्रों 15,16,17,18में प्रतिजन अभिव्यक्ति के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता है.

इन सबसे ऊपर, मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग और मात्रात्मक पैथोलॉजी विश्लेषण तकनीक के साथ जुड़े मल्टीलेबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना बड़ी संख्या में पता लगाने के लक्ष्य, प्रभावी धुंधला और सटीक विश्लेषण के फायदे हैं, और इसलिए यह हिस्टोमोर्फोलॉजिकल विश्लेषण की सटीकता में काफी सुधार कर सकता है, सेलुलर-स्तर के संकल्प के साथ प्रोटीन के बीच स्थानिक संबंध प्रकट करता है, और ऊतक अनुभाग नमूनों से समृद्ध और अधिक विश्वसनीय जानकारी को मेरा करने में मदद करता है19 (तालिका 1)।

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Protocol

प्रोटोकॉल को पश्चिम चीन अस्पताल, सिचुआन विश्वविद्यालय, चीन की आचार समिति के दिशानिर्देशों द्वारा अनुमोदित किया गया है। फेफड़े के कैंसर के ऊतकों के नमूने पश्चिम चीन अस्पताल में फेफड़ों के कैंसर के केंद्र में सर्जरी के दौरान प्राप्त किए गए थे, और प्रत्येक रोगी से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी।

1. ऊतक अनुभाग तैयारी

  1. एफएफपीई तैयारी
    1. 72 घंटे से अधिक के लिए तटस्थ फॉर्मेलिन समाधान में नैदानिक ऊतकों को विसर्जित करें।
    2. जाइलीन और वर्गीकृत मादक समाधान20 का उपयोग कर ऊतकों निर्जलीकरण की प्रक्रिया को पूरा करें.
    3. 4 माइक्रोन अनुभाग मोटाई पर मैनुअल पैराफिन एम्बेडिंग और ऊतक सेक्शनिंग करें। आसंजन माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग करें सुनिश्चित करें कि ऊतक स्लाइस बाहर गिर नहीं है.
    4. ऊतक और स्लाइड सूखी हैं कि सुनिश्चित करने के लिए 2 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में स्लाइड सेंकना. कमरे के तापमान पर एक स्लाइड बॉक्स में स्टोर करें।
  2. ऊतक अनुभाग pretreatment
    1. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में ऊतक स्लाइड का इलाज करें, और फिर क्रमिक रूप से 2 x 15 मिनट के लिए जाइलीन समाधान में विसर्जित करें, 2 x 15 मिनट के लिए निर्जल इथेनॉल समाधान, 10 मिनट के लिए 90% इथेनॉल समाधान, 10 मिनट के लिए 85% इथेनॉल समाधान, 10 मिनट के लिए 80% इथेनॉल समाधान, और 10 मिनट के लिए 75% इथेनॉल समाधान, 3 एक्स 1 मिनट के लिए निष्फल पानी के साथ स्लाइड धोने के द्वारा पीछा किया.
      नोट: इस प्रयोगात्मक तकनीक का उपयोग केवल एफएफपीई ऊतक के लिए किया जा सकता है, जमे हुए या ताजा ऊतक के लिए नहीं, क्योंकि कई उच्च तापमान प्रतिजन मरम्मत प्रक्रिया ऊतक को स्लाइड से गिरने का कारण बनती है।

2. प्राथमिक एंटीबॉडी का अनुकूलन

नोट: पारंपरिक आईएचसी प्रयोगों का उपयोग व्यक्तिगत एंटीबॉडी के लिए इनक्यूबेशन स्थितियों को निर्धारित करने के लिए किया गया था, जिसमें मुख्य रूप से एंटीबॉडी एकाग्रता और एंटीजन मरम्मत की स्थिति शामिल थी। एंटीबॉडी निर्देश पुस्तिका में शर्तों का संदर्भ लें।

  1. अनुशंसित एकाग्रता सीमा और मध्यवर्ती मूल्यों की तुलना में थोड़ा अधिक एंटीबॉडी एकाग्रता का उपयोग करें।
  2. प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्थान के अनुसार एंटीजन पुनर्प्राप्ति बफर दिनचर्या PH6 और PH9 का अनुकूलन करें। नाभिक में व्यक्त प्रोटीन के लिए PH9 का उपयोग करें और अन्य प्रोटीनों के लिए या तो नियमित (PH6 या PH9) का उपयोग करें।

3. एमआईएचसी धुंधला विधि

नोट: ओपल एमआईएचसी धुंधला उपलब्ध एमआईएचसी विधियों में से एक है। इस प्रयोगात्मक 5-रंग प्रोटोकॉल में, प्रत्येक ऊतक के नमूने को चार एंटीबॉडी, चार प्राथमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन, माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन, और टीएसए सिग्नल प्रवर्धन क्रोमोजेनिक ऊष्मायन के साथ-साथ पांच एंटीजन पुनर्स्थापनों के साथ दागने की आवश्यकता होती है। अंत में, 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) धुंधला और विरोधी फ्लोरोसेंट फट एजेंट सील प्रदर्शन कर रहे हैं.

  1. मुख्य अभिकर्मक तैयारी
    नोट: ऊतक स्लाइड के आकार के अनुसार जोड़े जाने वाले अभिकर्मक की मात्रा निर्धारित करें। ऊतक अनुभाग को पूरी तरह से कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा का उपयोग करें (आमतौर पर, स्लाइड प्रति 50-150 माइक्रोन)। प्रयोग के लिए आवश्यक कार्य समाधान निम्नानुसार तैयार किए जाते हैं:
    1. वॉश बफर वर्किंग सॉल्यूशन: डबल डिस्टिल्ड वॉटर के साथ 1:20 पर 20x वॉश बफर को पतला करें, और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    2. PH6 बफर वर्किंग सॉल्यूशन: डबल-डिस्टिल्ड वॉटर के साथ 1:100 पर 100x PH6 बफर को पतला करें। उपयोग से पहले तैयार करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    3. PH9 बफर वर्किंग सॉल्यूशन: डबल-डिस्टिल्ड वॉटर के साथ 1:50 बजे 50x PH9 बफर को पतला करें। उपयोग से पहले तैयार करें और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    4. पॉलिमर एचआरपी: केवल खरगोश और माउस मूल के प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए इस तैयार-से-उपयोग समाधान तैयार करें।
    5. फ्लोरोफोरे कार्य समाधान: डीएमएसओ के 75 माइक्रोन में प्रत्येक फ्लोरोफोर पाउडर (फ्लोरोफोर 780 को छोड़कर) का पुनर्गठन करें। प्रत्येक प्रक्रिया से पहले, फ्लोरोफोर को 1x प्रवर्धन मंदक में 1:100 पर पतला करें। फ्लोरोफोरे कार्य समाधान के किसी भी अप्रयुक्त हिस्से को त्याग दें।
    6. फ्लोरोफोरे 780 कार्य समाधान: डीएमएसओ के 75 माइक्रोन में टीएसए-डीआईजी और डबल-डिस्टिल्ड वॉटर के 300 माइक्रोन में फ्लोरोफोर पाउडर 780 का पुनर्गठन करें। प्रक्रिया से पहले, 1:100 पर 1x प्रवर्धन मंदक में टीएसए-डीआईजी को पतला करें, और 1:25 पर एबी मंदक के साथ फ्लोरोफोर 780 को पतला करें।
    7. DAPI कार्य समाधान: DAPI समाधान को 1:50 पर डबल-डिस्टिल्ड वॉटर या पीबीएस से पतला करें। उपयोग करने से पहले तैयार करें और 48 घंटे से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट। स्लाइड्स को केवल डबल-आसुत जल और ताजा तैयार वॉश बफर वर्किंग सॉल्यूशन के साथ इस मल्टीलेबल फ्लोरेसेंस धुंधला प्रयोग के दौरान धोएं। ऊतक वर्गों नल के पानी के साथ संपर्क में नहीं आना चाहिए; नल के पानी में दूषित पदार्थ ऊतक वर्गों का पालन कर सकते हैं और ऑटोफ्लोरेसेंस का कारण बन सकते हैं। प्रयोग के दौरान प्रकाश से दूर नमूने रखें.
  2. एंटीजन पुनर्प्राप्ति
    1. स्लाइड्स को धुंधला और मरम्मत बॉक्स में रखें और इसे PH6 या PH9 बफर वर्किंग सॉल्यूशन से भरें, ढक्कन के साथ कवर करें, और माइक्रोवेव ओवन में 2 x 8 मिनट के लिए 100% पावर पर हीट करें।
      नोट: अत्यधिक वाष्पीकरण को रोकने के लिए हीटिंग प्रक्रिया के दौरान मरम्मत बॉक्स में डबल-डिस्टिल्ड जल जोड़ें जिससे स्लाइस सूख सकते हैं।
    2. आगे बढ़ने से पहले स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर ठंडा करने दें (30-60 मिनट)।
    3. डबल आसुत जल के साथ स्लाइड 3 एक्स 2 मिनट धो लें. स्लाइड पर ऊतक अनुभाग को घेरने के लिए हाइड्रोफोबिक बैरियर पेन का उपयोग करें।
  3. अवरुद्ध
    1. धोने बफर में ऊतक वर्गों विसर्जित कर दिया, अवरुद्ध समाधान के साथ कवर, और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड सेते हैं.
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
    1. स्लाइड्स से अवरुद्ध समाधान निकालें और प्राथमिक एंटीबॉडी काम समाधान के साथ ऊतक वर्गों को कवर. इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए या रेफ्रिजरेटर में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड को इनक्यूबेट करें।
      नोट: स्लाइड्स को सूखने न दें।
  5. पॉलिमर एचआरपी का परिचय
    1. 3 x 2 मिनट के लिए धोने बफर काम समाधान में स्लाइड धो पॉलिमर एचआरपी सीधे ऊतक वर्गों के लिए ड्रॉपवाइज जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
      नोट: रेफ्रिजरेटर में संग्रहीत स्लाइड के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी को हटाने के लिए धोने से पहले लगभग 30 मिनट के लिए उन्हें कमरे के तापमान पर रखें।
  6. Tyramine संकेत प्रवर्धन (टीएसए) पीढ़ी
    1. 3 x 2 मिनट के लिए वॉश बफर वर्किंग सॉल्यूशन के साथ स्लाइड को धोएं, फ्लोरोफोरे वर्किंग सॉल्यूशन को सीधे टिशू सेक्शन में ड्रॉपवाइज जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 10 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। 3 x 2 मिनट के लिए धोने बफर काम समाधान के साथ स्लाइड धो लें.
  7. फ्लोरोफोर 780 के लिए विशेष प्रक्रिया
    नोट: फ्लोरोफोर 780 कमजोर है और नियमित रूप से पूरे प्रयोग के रंग-मिलान योजना में अंतिम स्थान पर रखा गया है। फ्लोरोफोरे 780 का उपयोग आमतौर पर इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में नहीं किया जाता है, लेकिन इसकी विशिष्टता के कारण, इसके प्रयोगात्मक चरण सूचीबद्ध हैं।
    1. टीएसए-डीआईजी का परिचय
      1. 3 x 2 मिनट के लिए धोने बफर काम समाधान के साथ स्लाइड धो लें, ऊतक वर्गों के लिए टीएसए-डीआरजी काम कर समाधान ड्रॉपवाइज जोड़ें, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
    2. माइक्रोवेव उपचार
      1. 3 x 2 मिनट के लिए धोने बफर काम समाधान के साथ स्लाइड धो लें.
      2. स्लाइड्स को धुंधला और मरम्मत बॉक्स में रखें, इसे मरम्मत समाधान से भरें, ढक्कन के साथ कवर करें, और माइक्रोवेव ओवन में 2 x 8 मिनट के लिए 100% शक्ति पर गरम करें। आगे बढ़ने से पहले स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर ठंडा करने दें (30-60 मिनट)।
      3. डबल आसुत जल के साथ 3 एक्स 2 मिनट के लिए स्लाइड धो लें.
    3. फ्लोरोफोर 780 सिग्नल जनरेशन
      1. धोने बफर में वर्गों विसर्जित फ्लोरोफोर 780 काम कर समाधान के साथ कवर, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड सेते हैं.
      2. 3 x 2 मिनट के लिए धोने बफर काम समाधान के साथ स्लाइड धो लें.
        नोट: इस चरण के बाद माइक्रोवेव उपचार न करें।
    4. पूरे वर्कफ़्लो के अंतिम चरण के रूप में फ्लोरोफोर 780 का उपयोग करें और फिर सीधे डीएपीआई वर्किंग सॉल्यूशन के साथ नाभिक को दाग दें।
      नोट: फ्लोरोफोर 780 का उपयोग नहीं करने पर चरण 3.7 छोड़ें।
  8. माइक्रोवेव उपचार
    नोट: यह माइक्रोवेव चरण प्राथमिक-माध्यमिक एचआरपी कॉम्प्लेक्स को स्ट्रिप्स करता है और एंटीजन को फिर से उजागर करता है, जिससे अगले प्राथमिक एंटीबॉडी की शुरूआत होती है।
    1. स्लाइड्स को धुंधला और मरम्मत बॉक्स में रखें, इसे PH6 या PH9 बफर वर्किंग सॉल्यूशन से भरें, ढक्कन के साथ कवर करें, और माइक्रोवेव ओवन में 2 x 8 मिनट के लिए 100% पावर पर गर्म करें।
    2. आगे बढ़ने से पहले स्लाइड्स को कमरे के तापमान पर ठंडा करने दें (30-60 मिनट)। डबल आसुत जल के साथ स्लाइड 3 एक्स 1 मिनट धो लें.
    3. 2 मिनट के लिए धोने बफर काम समाधान में स्लाइड डुबकी. अगले एंटीबॉडी इनक्यूबेशन करें।
  9. अगला एंटीबॉडी इनक्यूबेशन
    1. 3.2-3.8 (3.7 कदम को छोड़कर) कदम दोहराएँ.
  10. सेल परमाणु धुंधला और ऊतक सील
    1. डीएपीआई काम कर समाधान के साथ ऊतक वर्गों को कवर और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक आर्द्र कक्ष में स्लाइड सेते हैं. डबल आसुत जल के साथ 3 एक्स 2 मिनट के लिए स्लाइड धो लें.
    2. स्लाइड्स से पानी की बूंदों को निकालें, प्रत्येक स्लाइड में एंटी-फ्लोरेसेंस क्वेंचर के 10-20 माइक्रोन जोड़ें, और माइक्रोस्कोप कवर ग्लास के साथ स्लाइड्स को सील करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर तैयार स्लाइड्स स्टोर, प्रकाश से संरक्षित, अधिक से अधिक के लिए 1 महीने.
      नोट: हवाई बुलबुले से बचने के लिए ध्यान रखें।

4. नकारात्मक नियंत्रण सेट करें

  1. ऊतक युक्त स्लाइड की तरह नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड की प्रक्रिया करें, लेकिन प्राथमिक एंटीबॉडी, माध्यमिक एंटीबॉडी, टीएसए अभिकर्मकों और डीएपीआई जैसे अभिकर्मकों को जोड़ने के बिना, जो फिल्म को स्कैन करते समय ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस को हटाने के लिए उपयोग किया जाता है।

5. ऊतक स्लाइड की पूरी तरह से स्वचालित स्कैनिंग

नोट: वर्णक्रमीय इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण एक पूरी तरह से स्वचालित मल्टीस्पेक्ट्रल ऊतक परिमाणीकरण विश्लेषक है, और 5-रंग स्लाइड के इमेजिंग और विश्लेषण दृश्य को संदर्भित प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके किया जा सकता है। प्रणाली कई फ्लोरोफोर्स और ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस के मात्रात्मक अनमिक्सिंग के लिए मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग का उपयोग करती है।

  1. मैन्युअल रूप से प्रत्येक प्रतिदीप्ति चैनल के लिए जोखिम समय और स्कैनिंग कार्यक्रम सेट और साधन पूरी तरह से स्वत: जोखिम और ऊतक स्लाइड की स्कैनिंग पूरा कर लिया है कि पुष्टि करें.
    नोट: स्लाइड सतह साफ और पानी की फिल्म से मुक्त होनी चाहिए। सीलर की मात्रा से सावधान रहें: बहुत अधिक कवरस्लिप को फिसलने और उपकरण को त्रुटि की रिपोर्ट करने का कारण बनेगा।

6. प्रतिदीप्ति का विश्लेषण

  1. सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) डबल क्लिक करें, सॉफ्टवेयर में मूल स्कैन से प्राप्त बहुरंगा प्रतिदीप्ति छवि फ़ाइल खींचें, और प्रतिदीप्ति के लिए छवि प्रकार सेट.
  2. चमक और कंट्रास्ट बटन पर क्लिक करें और पैनल पर चैनलों की जांच करें। ब्याज की प्रतिदीप्ति चैनल का चयन करने के लिए बाहर और फिर चैनल पर क्लिक करें. प्रत्येक चैनल की चमक और कंट्रास्ट समायोजित करने के लिए न्यूनतम प्रदर्शन और अधिकतम प्रदर्शन को खींचें।
  3. विश्लेषण के बाद, सहेजे जाने वाले दृश्य का निर्धारण करें, इन दो सामग्रियों को हटाने के लिए स्लाइड अवलोकन दिखाएं और कर्सर स्थान दिखाएं पर क्लिक करें, स्केल बार रखें, और क्लिक करें फ़ाइल | स्नैपशॉट निर्यात करें | png फ़ाइल निर्यात करने के लिए वर्तमान दर्शक सामग्री।
    नोट: हर प्रतिदीप्ति चैनल और एक विलय आंकड़ा भविष्य के विश्लेषण के लिए निर्यात किया जाना चाहिए.
  4. लक्ष्य सेल सकारात्मकता के आगे विश्लेषण के लिए, सेल पहचान और विभाजन सॉफ्टवेयर21 का उपयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।

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Representative Results

हमने सीडी 8 प्राथमिक एंटीबॉडी और फ्लोरोफोर्स की मिलान योजना को अनुकूलित किया। प्रतिदीप्ति परिणामों के दोनों सेट प्रयोगात्मक समूह में बिल्कुल समान एंटीबॉडी इनक्यूबेशन स्थितियों के अनुरूप थे, एंटीबॉडी-मिलान वाले फ्लोरोफोर में परिवर्तन को छोड़कर। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, फ्लोरोफोर 480 और फ्लोरोफोर 690 के साथ सीडी 8+ टी कोशिकाओं के चैनल मिलान में महत्वपूर्ण अंतर था। फ्लोरोफोरे 690 वाला चैनल एक अत्यंत मजबूत फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि दिखाता है- पीले सर्कल के भीतर लाल अनियमित प्रतिदीप्ति का बड़ा क्षेत्र रंग दिखाता है, जो सीडी 8 + टी कोशिकाओं (चित्रा 2सी, डी) के स्थानीयकरण विश्लेषण में बहुत हस्तक्षेप का कारण बनता है। हालांकि, फ्लोरोफोर 480 वाला चैनल एक बहुत ही विशिष्ट सीडी 8 सेल झिल्ली सकारात्मकता और कोई फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि नहीं दिखाता है। इस प्रकार, पीले घेरे एक बहुत स्पष्ट सकारात्मक कोशिका झिल्ली(चित्रा 2ए)दिखाते हैं, जो इस प्रोटोकॉल में एंटीबॉडी और प्रतिदीप्ति चैनल मिलान के महत्व को पूरी तरह से दिखाता है।

मैक्रोफेज और साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं के वितरण की जांच गैर-छोटे सेल फेफड़े स्क्वैमस कार्सिनोमा ऊतकों में की गई थी, और ट्यूमर कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं में विशेषता प्रोटीन एचएमजीसीएस 1 की अभिव्यक्ति सत्यापित की गई थी। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, चित्र QuPath 0.3.2 से प्राप्त किए गए थे। एमआईएचसी पैनल फ्लोरोफोर्स 480, 520, 620, 690 और डीएपीआई था, और संबंधित एंटीबॉडी मार्कर सीके 5/6 थे, जो फेफड़े के स्क्वैमस कार्सिनोमा कोशिकाओं के लिए एक मार्कर था; सीडी 8, टी कोशिकाओं के लिए एक मार्कर; सीडी 68, मैक्रोफेज के लिए एक मार्कर; और HMGCS1, जो प्लाज्मा पॉजिटिव ट्यूमर कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है। मैक्रोफेज और सीडी 8 + टी कोशिकाओं ने भारी घुसपैठ दिखाई और स्क्वैमस कार्सिनोमा फॉसी के आसपास और भीतर वितरित किए गए, जबकि एचएमजीसीएस 1 को स्क्वैमस कार्सिनोमा सेल प्लाज्मा में व्यापक रूप से व्यक्त किया गया था, जो मजबूत ट्यूमर सेल सकारात्मकता दिखा रहा था।

Figure 1
चित्रा 1: एफएफपीई ऊतक के लिए मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला का कार्यप्रवाह। संक्षिप्तीकरण: FFPE = फॉर्मेलिन-फिक्स्ड और पैराफिन-एम्बेडेड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: सीडी 8 और फ्लोरोफोर्स के लिए मिलान प्रोटोकॉल का अनुकूलन। फ्लोरोफोर 480 और फ्लोरोफोर 690 के साथ सीडी 8+ टी कोशिकाओं के चैनल मिलान में एक महत्वपूर्ण अंतर था। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: फेफड़े स्क्वैमस कार्सिनोमा में मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला। "गैर-छोटे सेल फेफड़े के स्क्वैमस कार्सिनोमा ऊतकों में मैक्रोफेज और साइटोटॉक्सिक टी कोशिकाओं का वितरण और ट्यूमर कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं में विशेषता प्रोटीन एचएमजीसीएस 1 की अभिव्यक्ति"। CK5/6 फेफड़े के स्क्वैमस कार्सिनोमा कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है; सीडी 8 टी कोशिकाओं के लिए एक मार्कर है; सीडी 68 मैक्रोफेज के लिए एक मार्कर है; और HMGCS1 ट्यूमर सेल प्लाज्मा पॉजिटिव कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है। स्केल सलाखों = 50 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मल्टीप्लेक्स इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री तकनीक पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक
आणविक लक्ष्यों की संख्या असीमित (एक बार में 9 प्रकार की रंगाई, DAPI सहित) सामान्य अंकन 3-4 प्रकार (DAPI सहित)
छवि अधिग्रहण उच्च धुंधला संकल्प और धुंधला विशिष्टता, सिग्नलिंग प्रवर्धन, मजबूत संकेत तीव्रता, लंबे समय तक शमन समय, कोई पृष्ठभूमि प्रभाव, और प्रत्येक लक्ष्य साइट पर बहुत अधिक सिग्नल-टू-शोर अनुपात। कमजोर चमक, आसान शमन, विभिन्न एंटीबॉडी के बीच आपसी प्रभाव, उच्च पृष्ठभूमि
डेटा विश्लेषण क्षेत्र विशिष्टता, सेल विभाजन, एकल-कोशिका स्थानिक जानकारी नग्न आंखों का अवलोकन और ImageJ द्वारा सटीक मात्रा का ठहराव

तालिका 1: ओपल मल्टी-लेबलिंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक और पारंपरिक इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक के बीच तुलना।

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Discussion

एमआईएचसी एक एकल ऊतक खंड में एकल-कोशिका स्तर पर कई प्रोटीन मार्करों के मात्रात्मक और स्थानिक विश्लेषण के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान के क्षेत्र में एक अनिवार्य प्रयोगात्मक तकनीक है, जो विस्तृत ऊतक संरचना पर ध्यान केंद्रित करके रोग विकृति विज्ञान के अध्ययन के लिए सहज और सटीक डेटा प्रदान करती है। एमआईएचसी प्रौद्योगिकी को व्यापक रूप से अपनाने के लिए अनुकूलित और प्रभावी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल की आवश्यकता होगी। प्रयोगों में उत्पन्न होने वाली समस्याओं का समाधान करने के लिए, हम निम्नलिखित विचार और समाधान प्रस्तुत करते हैं।

सबसे पहले, बहु-रंग प्रयोगों में एंटीजन और फ्लोरेसिन-लेबल एंटीबॉडी के मिलान के सिद्धांत के अनुसार, कमजोर रूप से व्यक्त एंटीजन दृढ़ता से फ्लोरेसिन-लेबल एंटीबॉडी के साथ मेल खाता है, और दृढ़ता से व्यक्त एंटीजन कमजोर फ्लोरेसिन-लेबल एंटीबॉडी के साथ मेल खाता है। एकल एंटीबॉडी-लेबल एंटीजन के आईएचसी प्रयोगों के परिणामों के साथ संयुक्त, लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति की तीव्रता निर्धारित की जाती है, और एंटीबॉडी और फ्लोरेसिन के मिलान को समायोजित किया जाता है, अंत में बहु-रंग लेबलिंग प्रयोगों में आवश्यक एंटीबॉडी और फ्लोरेसिन की मिलान योजना का निर्धारण किया जाता है। एंटीबॉडी के विभिन्न प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तरों के साथ आसन्न प्रतिदीप्ति चैनल आसन्न प्रतिदीप्ति चैनल स्ट्रिंग रंग की समस्या को हल कर सकते हैं। दूसरा, प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने के लिए सॉफ्टवेयर सेटिंग्स इमेजिंग सना हुआ स्लाइड के लिए अकोया बायोसाइंसेज इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके सेट किए गए थे, और प्रतिदीप्ति अधिग्रहण मापदंडों को मल्टीस्पेक्ट्रल स्कैनिंग सॉफ्टवेयर फेनोचार्ट 1.0 का उपयोग करके सेट किया गया था, जो प्रतिदीप्ति संकेत संतुलन22 की जांच करने की अनुमति देता है। यह अनुशंसा की जाती है कि एक्सपोजर का समय एकल प्रतिदीप्ति चैनल के लिए 100 एमएस के भीतर हो और अधिक सजातीय होना चाहिए और कई प्रतिदीप्ति चैनलों के लिए 200 एमएस से अधिक नहीं होना चाहिए। प्रतिदीप्ति मापदंडों को आईएचसी-अनुकूलित एंटीबॉडी इनक्यूबेशन स्थितियों के आधार पर समायोजित किया जाता है।

तीसरा, ऑटोफ्लोरेसेंस की समस्या का विश्लेषण एक रिक्त नियंत्रण स्थापित करके किया जा सकता है, जो मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग की विशेषता वर्णक्रमीय पहचान के साथ संयुक्त है। यह मिश्रित रंग संकेतों की पहचान कर सकता है और, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड नमूनों के लिए, ऊतक ऑटोफ्लोरेसेंस23 को हटाकर परिमाण के लगभग एक क्रम से छवियों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार कर सकता है। चौथा, ऊतक-निरर्थक गुणजनात्मकता को संबोधित करने के लिए, खराब ऊतक विशिष्टता वाले एंटीबॉडी का उपयोग पशु गैर-प्रतिरक्षी सीरम के साथ एक अवरुद्ध समाधान के रूप में किया जाना चाहिए, आमतौर पर प्राथमिक एंटीबॉडी से पहले जोड़ा जाता है। चयनित सीरम प्रजातियां आमतौर पर माध्यमिक एंटीबॉडी प्रजातियों के स्रोत के समान होती हैं, जो निरर्थक गुणजनात्मकता को कम कर सकती हैं। पांचवां, प्रयोगात्मक गुणवत्ता नियंत्रण के रूप में नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण स्थापित करने की सिफारिश की जाती है। सकारात्मक नियंत्रण में अभिकर्मकों की गुणवत्ता की जांच करने की भूमिका होती है, और नकारात्मक नियंत्रण में प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं की गुणवत्ता की पुष्टि करने और स्लाइड स्कैन करते समय ऑटोफ्लोरेसेंस को हटाने का दोहरा कार्य होता है। संयोजन प्रत्येक प्रयोग की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. छठा, प्रयोग के दौरान स्लाइड धोने कदम बहुत महत्वपूर्ण है. प्रोटोकॉल में तैयार अभिकर्मकों का उपयोग किया जाना चाहिए, और धोने के समय का उपयोग अगले चरण में लेबलिंग के साथ हस्तक्षेप को रोकने के लिए प्रत्येक चरण में स्लाइड से अभिकर्मकों को धोने के लिए किया जाना चाहिए।

जब एक एकल प्रतिदीप्ति चैनल की विशिष्टता खराब होती है, जिसके परिणामस्वरूप निरर्थक सकारात्मकता और प्रतिदीप्ति क्रॉसस्टॉक होता है, तो उपयोगकर्ताओं को उपयुक्त एंटीबॉडी के आईएचसी परिणाम की जांच करनी चाहिए, सकारात्मक परिणाम की पुष्टि करनी चाहिए, और फिर, प्रासंगिक फ्लोरोफोर को बदलने पर विचार करना चाहिए। यदि एक भी सकारात्मक प्रतिदीप्ति परिणाम बहुत कमजोर या बहुत मजबूत है, तो फिल्म स्कैनिंग मापदंडों को 10-150 एमएस के अनुशंसित फ्लोरोफोर एक्सपोजर समय पर रीसेट करना महत्वपूर्ण है।

यह एकाधिक लेबलिंग विधि वर्तमान में पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक नमूनों तक सीमित है, क्योंकि प्रोटीन लेबलिंग प्रक्रिया के लिए कई एंटीजेनिक थर्मल मरम्मत की आवश्यकता होती है, जिसके लिए ऊतक को टूटने से रोकने के लिए तय करने की आवश्यकता होती है। ताजा ऊतक के जमे हुए खंड थर्मल मरम्मत के कारण होने वाले नुकसान का सामना नहीं करेंगे, और बड़ी मात्रा में ऊतक खो जाएंगे।

सारांश में, सीटू लेबलिंग विधि में यह एकाधिक एंटीजन कम समय लेने वाली है, जिसमें 3 घंटे से कम का एकल एंटीबॉडी लेबलिंग प्रक्रिया समय होता है। यह व्यक्तिगत प्रोटीन लेबलिंग स्थितियों और प्रयोगात्मक समूह और प्रतिदीप्ति चैनल सेटिंग्स के संदर्भ में एमआईएचसी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का अनुकूलन करने के लिए एक मल्टीस्पेक्ट्रल इमेजिंग सिस्टम और पेशेवर पैथोलॉजी विश्लेषण सॉफ्टवेयर के फायदों को जोड़ती है।

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Disclosures

सभी लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक क्लिनिकल पैथोलॉजी रिसर्च इंस्टीट्यूट वेस्ट चाइना हॉस्पिटल के सदस्यों को स्वीकार करना चाहते हैं, जिन्होंने गुणवत्ता मल्टीप्लेक्स इम्यूनोफ्लोरेसेंस और आईएचसी प्रसंस्करण के लिए तकनीकी मार्गदर्शन में योगदान दिया। इस प्रोटोकॉल चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया (82200078).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Anti-CD8 Abcam ab237709 Primary antibody, 1/100, PH9
Anti-CD68 Abcam ab955 Primary antibody, 1/300, PH9
Anti-CK5/6 Millipore MAB1620 Primary antibody, 1/150, PH9
Anti-HMGCS1 GeneTex GTX112346 Primary antibody, 1/300, PH6
Animal nonimmune serum MXB Biotechnologies SP KIT-B3 Antigen blocking
Fluormount-G SouthernBiotech 0100-01 Anti-fluorescent burst
Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit Akoya NEL861001KT Opal mIHC Staining
Wash Buffer Dako K8000/K8002/K8007/K8023 Washing the tissues slides
Software
HALO intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
inForm intelligent quantitative tissue analysis software, paid software
PerkinElmer Vectra multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides.
QuPath 0.3.2 intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment.

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References

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Yang, Y., Huang, H., Li, L., Yang, Y. Multiplex Immunohistochemistry Staining for Paraffin-embedded Lung Cancer Tissue. J. Vis. Exp. (201), e65850, doi:10.3791/65850 (2023).

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