Summary
يصف هذا البروتوكول التجريبي ويحسن طريقة تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية المتعددة (IHC) ، وذلك أساسا عن طريق تحسين ظروف حضانة الأجسام المضادة أحادية القناة وضبط إعدادات الأجسام المضادة والقنوات لحل مشاكل التألق الذاتي وتداخل القناة في أنسجة سرطان الرئة ذات الأصل السريري.
Abstract
سرطان الرئة هو السبب الرئيسي للمراضة والوفيات المرتبطة بالأورام الخبيثة في جميع أنحاء العالم ، وقد اعتبرت البيئة المكروية المعقدة للورم السبب الرئيسي للوفاة في مرضى سرطان الرئة. يتطلب تعقيد البيئة المكروية للورم طرقا فعالة لفهم العلاقات بين الخلايا في أنسجة الورم. أصبحت تقنية الكيمياء الهيستولوجية المناعية المتعددة (mIHC) أداة رئيسية لاستنتاج العلاقة بين التعبير عن البروتينات في المنبع والمصب لمسارات الإشارات في أنسجة الورم وتطوير التشخيصات السريرية وخطط العلاج. mIHC هي طريقة تلطيخ مناعي متعدد الملصقات تعتمد على تقنية تضخيم إشارة التيرامين (TSA) ، والتي يمكنها اكتشاف جزيئات مستهدفة متعددة في نفس عينة قسم الأنسجة في وقت واحد لتحقيق تعبير مشترك مختلف للبروتين وتحليل التوطين المشترك. في هذا البروتوكول التجريبي ، تعرضت أقسام الأنسجة المضمنة بالبارافين لسرطان الرئة الحرشفية من أصل سريري لتلطيخ كيميائي مناعي متعدد الإرسال. من خلال تحسين البروتوكول التجريبي ، تم تحقيق تلطيخ كيميائي مناعي متعدد للخلايا والبروتينات المستهدفة المصنفة ، مما أدى إلى حل مشكلة التألق الذاتي والحديث المتبادل للقناة في أنسجة الرئة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام التلوين الكيميائي المناعي المتعدد على نطاق واسع في التحقق التجريبي من التسلسل عالي الإنتاجية المرتبط بالورم ، بما في ذلك تسلسل الخلية الواحدة ، والبروتينات ، وتسلسل مساحة الأنسجة ، مما يوفر نتائج تحقق بديهية وبصرية لعلم الأمراض.
Introduction
تضخيم إشارة التيرامين (TSA) ، الذي له تاريخ يزيد عن 20 عاما ، هو فئة من تقنيات الفحص التي تستخدم بيروكسيديز الفجل (HRP) لوضع العلامات عالية الكثافة في الموقع للمستضدات المستهدفة ويتم تطبيقها على نطاق واسع في مقايسات الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISAs) ، والتهجين في الموقع (ISH) ، والكيمياء الهيستولوجية المناعية (IHC) ، وغيرها من التقنيات للكشف عن المستضدات البيولوجية ، تحسين حساسية الإشارة المكتشفة بشكل كبير1. تم مؤخرا تطوير تلطيخ أوبال متعدد الألوان على أساس تقنية TSA واستخدامه على نطاق واسع في العديد من الدراسات2،3،4،5. يوفر التلوين المناعي التقليدي (IF) للباحثين أداة سهلة للكشف عن توزيع البروتينات في خلايا وأنسجة الكائنات الحية النموذجية المختلفة ومقارنتها. يعتمد على الارتباط الخاص بالأجسام المضادة / المستضد ويتضمن طرقا مباشرة وغير مباشرة6. يتضمن التلوين المناعي المباشر استخدام جسم مضاد أولي مقترن بالفلوروفور ضد المستضد محل الاهتمام ، مما يتيح الكشف الفلوري المباشر باستخدام مجهر مضان. يتضمن نهج التلوين المناعي غير المباشر تطبيق جسم مضاد ثانوي مقترن بالفلوروفور ضد الجسم المضاد الأولي غير المقترن 6,7.
يمكن لطرق تلطيخ التألق المناعي التقليدية أحادية التسمية أن تلطخ مستضدا واحدا أو اثنين أو في بعض الحالات ثلاثة مستضدات في الأنسجة ، وهو قيد رئيسي في استخراج المعلومات الغنية الموجودة في أقسام الأنسجة. غالبا ما يعتمد تفسير النتائج الكمية على الملاحظة البصرية والقياس الكمي الدقيق بواسطة برامج التصوير ، مثل ImageJ. هناك قيود تقنية ، مثل تقييد أنواع الأجسام المضادة ، وإشارات الملصقات الفلورية الضعيفة ، وتداخل لون صبغة الفلورسنت (الجدول 1). تعتمد تقنية Opal multiplex IHC (mIHC) على اشتقاق TSA ، والذي يسمح بتلطيخ متعدد الإرسال ووضع العلامات التفاضلية لأكثر من 7-9 مستضدات على نفس قسم الأنسجة ، دون قيود على أصل الجسم المضاد الأساسي ، ولكنه يتطلب خصوصية عالية للجسم المضاد المقابل ضد المستضد. يشبه إجراء التلوين إجراء التلوين المناعي الطبيعي ، باستثناء اختلافين: تتضمن كل جولة من التلوين استخدام جسم مضاد واحد فقط ويتم إضافة خطوة شطف الأجسام المضادة. يمكن إزالة الأجسام المضادة المرتبطة بالمستضد بواسطة روابط غير تساهمية عن طريق شطف الميكروويف ، ولكن يتم الاحتفاظ بإشارة الفلورسنت TSA المرتبطة بسطح المستضد بواسطة الروابط التساهمية.
جزيئات التيرامين المنشط (T) الموسومة بالصبغة غنية للغاية في المستضد المستهدف ، مما يسمح بالتضخيم الفعال لإشارة الفلورسنت. يسمح ذلك بوضع العلامات المباشرة للمستضد دون تدخل الأجسام المضادة ، ومن ثم يمكن تحقيق وضع العلامات متعددة الألوان بعد دورات تلطيخ متعددة8،9،10 (الشكل 1). على الرغم من أن هذه التقنية تنتج صورا موثوقة ودقيقة لدراسة المرض ، إلا أن إنشاء استراتيجية تلطيخ مفيدة للكيمياء المناعية الفلورية المتعددة (mfIHC) يمكن أن يستغرق وقتا طويلا ودقيقا بسبب الحاجة إلى التحسين والتصميم الشاملين. لذلك ، تم تحسين بروتوكول اللوحة المتعددة هذا في ملطخ IHC الآلي مع وقت تلطيخ أقصر من البروتوكول اليدوي. يمكن تطبيق هذا النهج وتكييفه مباشرة من قبل أي باحث لدراسات الأورام المناعية على عينات الأنسجة البشرية الثابتة بالفورمالين والمضمنة بالبارافين (FFPE)11. علاوة على ذلك ، فإن طرق إعداد الشرائح وتحسين الأجسام المضادة وتصميم تعدد الإرسال ستكون مفيدة في الحصول على صور قوية تمثل تفاعلات خلوية دقيقة في الموقع وتقصير فترة التحسين للتحليل اليدوي12.
يتضمن mfIHC بشكل أساسي الحصول على الصور وتحليل البيانات. فيما يتعلق بالحصول على الصور ، يجب الكشف عن العينات المعقدة متعددة الألوان باستخدام معدات التصوير الطيفي الاحترافية لتحديد إشارات الألوان المختلطة المختلفة والحصول على صور عالية الإشارة إلى الضوضاء دون تدخل من التألق الذاتي للأنسجة. تشمل المعدات الحالية للتصوير الطيفي بشكل أساسي المجاهر الطيفية متحدة البؤر وأنظمة تصوير الأنسجة متعددة الأطياف. نظام تصوير الأنسجة متعدد الأطياف هو نظام تصوير احترافي مصمم للتحليل الكمي لأقسام الأنسجة ، وأهم ميزة له هي الحصول على المعلومات الطيفية للصور ، والتي توفر كلا من البنية المورفولوجية ومعلومات رسم الخرائط البصرية لعينات الأنسجة البيولوجية13,14. يحتوي أي بكسل في الصورة الطيفية على منحنى طيفي كامل ، ولكل صبغة (بما في ذلك التألق الذاتي) طيفها المميز المقابل ، والذي يتيح التسجيل الكامل والتحديد الدقيق للإشارات متعددة الملصقات المختلطة والمتداخلة.
من حيث تحليل البيانات ، فإن العينات ذات العلامات متعددة الألوان معقدة للغاية بسبب التركيب المورفولوجي والخلايا المكونة لعينات الأنسجة. لا يمكن للبرامج العادية تحديد أنواع الأنسجة المختلفة تلقائيا. ومن ثم ، يتم استخدام برنامج تحليل الأنسجة الكمي الذكي للتحليل الكمي للتعبير عن المستضد في مناطق محددة15،16،17،18.
قبل كل شيء ، يتميز تلطيخ التألق المناعي متعدد العلامات المنصهر مع التصوير متعدد الأطياف وتكنولوجيا تحليل الأمراض الكمي بمزايا عدد كبير من أهداف الكشف ، والتلوين الفعال ، والتحليل الدقيق ، وبالتالي يمكنه تحسين دقة التحليل النسيجي بشكل كبير ، والكشف عن العلاقة المكانية بين البروتينات ذات الدقة الخلوية ، والمساعدة في استخراج معلومات أكثر ثراء وموثوقية من عينات قسم الأنسجة19 (الجدول 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على البروتوكول من خلال المبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات في مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان ، الصين. تم الحصول على عينات أنسجة سرطان الرئة أثناء الجراحة في مركز سرطان الرئة في مستشفى غرب الصين ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من كل مريض.
1. إعداد قسم الأنسجة
- إعداد FFPE
- اغمر الأنسجة السريرية في محلول فورمالين محايد لأكثر من 72 ساعة.
- أكمل عملية تجفيف الأنسجة باستخدام الزيلين والمحاليل الكحولية المتدرجة20.
- قم بإجراء التضمين اليدوي للبارافين وتقسيم الأنسجة بسمك مقطع 4 ميكرومتر. استخدم شرائح مجهر الالتصاق للتأكد من عدم سقوط شرائح الأنسجة.
- تخبز الشرائح في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للتأكد من جفاف المناديل والشرائح. تخزينها في صندوق شرائح في درجة حرارة الغرفة.
- المعالجة المسبقة لقسم الأنسجة
- عالج شرائح الأنسجة في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم اغمر بالتتابع في محاليل الزيلين لمدة 2 × 15 دقيقة ، ومحاليل الإيثانول اللامائية لمدة 2 × 15 دقيقة ، ومحلول إيثانول 90٪ لمدة 10 دقائق ، ومحلول إيثانول 85٪ لمدة 10 دقائق ، ومحلول إيثانول 80٪ لمدة 10 دقائق ، ومحلول إيثانول 75٪ لمدة 10 دقائق ، يليه غسل الشرائح بالماء المعقم لمدة 3 × 1 دقيقة.
ملاحظة: لا يمكن استخدام هذه التقنية التجريبية إلا لأنسجة FFPE ، وليس للأنسجة المجمدة أو الطازجة ، حيث تتسبب عملية إصلاح المستضد المتعددة ذات درجة الحرارة العالية في سقوط الأنسجة من الشريحة.
- عالج شرائح الأنسجة في فرن على حرارة 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم اغمر بالتتابع في محاليل الزيلين لمدة 2 × 15 دقيقة ، ومحاليل الإيثانول اللامائية لمدة 2 × 15 دقيقة ، ومحلول إيثانول 90٪ لمدة 10 دقائق ، ومحلول إيثانول 85٪ لمدة 10 دقائق ، ومحلول إيثانول 80٪ لمدة 10 دقائق ، ومحلول إيثانول 75٪ لمدة 10 دقائق ، يليه غسل الشرائح بالماء المعقم لمدة 3 × 1 دقيقة.
2. تحسين الأجسام المضادة الأولية
ملاحظة: تم استخدام تجارب IHC التقليدية لتحديد ظروف حضانة الأجسام المضادة الفردية ، بما في ذلك تركيز الأجسام المضادة وظروف إصلاح المستضد. راجع الشروط الواردة في دليل تعليمات الأجسام المضادة.
- استخدم تركيز الأجسام المضادة أعلى قليلا من نطاق التركيز الموصى به والقيم المتوسطة.
- تحسين إجراءات المخزن المؤقت لاسترجاع المستضد PH6 و PH9 وفقا لموقع تعبير البروتين. استخدم PH9 للبروتينات المعبر عنها في النواة واستخدم إما روتينا (PH6 أو PH9) للبروتينات الأخرى.
3. طريقة تلطيخ mIHC
ملاحظة: يعد تلطيخ mIHC من الأوبال إحدى طرق mIHC المتاحة. في هذا البروتوكول التجريبي المكون من 5 ألوان ، حيث يجب تلطيخ كل عينة من الأنسجة بأربعة أجسام مضادة ، وأربعة حضانات أولية للأجسام المضادة ، وحضانات ثانوية للأجسام المضادة ، وحضانات كروموجينية لتضخيم إشارة TSA ، بالإضافة إلى خمس عمليات ترميم للمستضد. أخيرا ، يتم إجراء تلطيخ 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) وختم عامل الانفجار المضاد للفلورسنت.
- إعداد الكاشف الرئيسي
ملاحظة: حدد كمية الكاشف المراد إضافتها وفقا لحجم شرائح الأنسجة. استخدم حجما كافيا لتغطية قسم الأنسجة بالكامل (بشكل عام ، 50-150 ميكرولتر لكل شريحة). يتم إعداد حلول العمل المطلوبة للتجربة على النحو التالي:- غسل محلول عمل المخزن المؤقت: تمييع 20x اغسل المخزن المؤقت في الساعة 1:20 بالماء المقطر المزدوج ، واحفظه في درجة حرارة الغرفة.
- حل عمل المخزن المؤقت PH6: قم بتخفيف المخزن المؤقت 100x PH6 عند 1: 100 بالماء المقطر المزدوج. تحضير قبل الاستخدام وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- حل عمل المخزن المؤقت PH9: قم بتخفيف المخزن المؤقت 50x PH9 في الساعة 1:50 بالماء المقطر المزدوج. تحضير قبل الاستخدام وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- بوليمر HRP: قم بإعداد هذا الحل الجاهز للاستخدام فقط للأجسام المضادة الأولية من أصل الأرانب والفأر.
- محلول عمل الفلوروفور: أعد تكوين كل مسحوق فلوروفور (باستثناء الفلوروفور 780) في 75 ميكرولتر من DMSO. قبل كل إجراء ، قم بتخفيف الفلوروفور في مخفف تضخيم 1x عند 1: 100. تخلص من أي جزء غير مستخدم من محلول عمل الفلوروفور.
- حل عمل Fluorophore 780: إعادة تكوين TSA-DIG في 75 ميكرولتر من DMSO ومسحوق الفلوروفور 780 في 300 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. قبل الإجراء ، قم بتخفيف TSA-DIG في مخفف تضخيم 1x عند 1: 100 ، وتخفيف الفلوروفور 780 مع مخفف Ab في 1:25.
- حل عمل DAPI: قم بتخفيف محلول DAPI في الساعة 1:50 بالماء المقطر المزدوج أو PBS. تحضير قبل الاستخدام وتخزينها على حرارة 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 48 ساعة.
ملاحظه. اغسل الشرائح فقط بالماء المقطر المزدوج ومحلول عمل عازل الغسيل المعد حديثا طوال تجربة تلطيخ التألق متعددة الملصقات هذه. يجب ألا تتلامس أقسام الأنسجة مع ماء الصنبور ؛ يمكن أن تلتصق الملوثات الموجودة في ماء الصنبور بأقسام الأنسجة وتسبب التألق الذاتي. احتفظ بالعينات بعيدا عن الضوء طوال التجربة.
- استرجاع المستضد
- ضع الشرائح في صندوق تلطيخ وإصلاح واملأها بمحلول عمل عازل PH6 أو PH9 ، وقم بتغطيتها بالغطاء ، وقم بتسخينها في فرن ميكروويف لمدة 2 × 8 دقائق بطاقة 100٪.
ملاحظة: أضف الماء المقطر المزدوج إلى صندوق الإصلاح أثناء عملية التسخين لمنع التبخر المفرط الذي يمكن أن يتسبب في جفاف الشرائح. - اترك الشرائح لتبرد في درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة (30-60 دقيقة).
- اغسل الشرائح 3 × 2 دقيقة بالماء المقطر المزدوج. استخدم قلم حاجز مسعور لتطويق قسم الأنسجة على الشريحة.
- ضع الشرائح في صندوق تلطيخ وإصلاح واملأها بمحلول عمل عازل PH6 أو PH9 ، وقم بتغطيتها بالغطاء ، وقم بتسخينها في فرن ميكروويف لمدة 2 × 8 دقائق بطاقة 100٪.
- حظر
- اغمر أقسام الأنسجة في محلول الغسيل ، وقم بتغطيتها بمحلول مانع ، واحتضان الشرائح في غرفة مرطبة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- حضانة الأجسام المضادة الأولية
- قم بإزالة محلول الحجب من الشرائح وقم بتغطية أقسام الأنسجة بمحلول عمل الأجسام المضادة الأساسي. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في الثلاجة.
ملاحظة: لا تدع الشرائح تجف.
- قم بإزالة محلول الحجب من الشرائح وقم بتغطية أقسام الأنسجة بمحلول عمل الأجسام المضادة الأساسي. احتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في الحاضنة أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في الثلاجة.
- إدخال البوليمر HRP
- اغسل الشرائح في محلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة. أضف Polymer HRP مباشرة إلى أقسام الأنسجة واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: بالنسبة للشرائح المخزنة في الثلاجة ، احتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تقريبا قبل الغسيل لإزالة الجسم المضاد الأساسي.
- اغسل الشرائح في محلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة. أضف Polymer HRP مباشرة إلى أقسام الأنسجة واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- توليد تضخيم إشارة التيرامين (TSA)
- اغسل الشريحة بمحلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة ، وأضف محلول عمل الفلوروفور مباشرة بالتنقيط إلى أقسام الأنسجة ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشريحة بمحلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة.
- إجراء خاص للفلوروفور 780
ملاحظة: الفلوروفور 780 ضعيف ويتم وضعه بشكل روتيني في المرتبة الأخيرة في مخطط مطابقة الألوان للتجربة بأكملها. لا يستخدم Fluorophore 780 عادة في هذا البروتوكول التجريبي ، ولكن بسبب خصوصيته ، يتم سرد خطواته التجريبية.- مقدمة من TSA-DIG
- اغسل الشريحة بمحلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة ، وأضف محلول عمل TSA-Drg بالتنقيط إلى أقسام الأنسجة ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- معالجة الميكروويف
- اغسل الشرائح بمحلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة.
- ضع الشرائح في صندوق تلطيخ وإصلاح ، واملأها بمحلول إصلاح ، وقم بتغطيتها بالغطاء ، وقم بتسخينها في فرن ميكروويف لمدة 2 × 8 دقائق بطاقة 100٪. اترك الشرائح لتبرد في درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة (30-60 دقيقة).
- اغسل الشرائح لمدة 3 × 2 دقيقة بالماء المقطر المزدوج.
- توليد إشارة الفلوروفور 780
- اغمر الأقسام في محلول الغسيل ، وقم بتغطيتها بمحلول عمل fluorophore 780 ، واحتضان الشرائح في غرفة مرطبة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الشرائح بمحلول عمل عازل للغسيل لمدة 3 × 2 دقيقة.
ملاحظة: لا تقم بإجراء العلاج بالميكروويف بعد هذه الخطوة.
- استخدم الفلوروفور 780 كخطوة أخيرة في سير العمل بأكمله ثم قم بتلطيخ النوى مباشرة باستخدام حل عمل DAPI.
ملاحظة: تخطي الخطوة 3.7 إذا لم تستخدم الفلوروفور 780.
- مقدمة من TSA-DIG
- معالجة الميكروويف
ملاحظة: تعمل خطوة الميكروويف هذه على تجريد مركب HRP الأساسي والثانوي وإعادة كشف المستضدات ، مما يسمح بإدخال الجسم المضاد الأساسي التالي.- ضع الشرائح في صندوق تلطيخ وإصلاح ، واملأها بمحلول عمل عازل PH6 أو PH9 ، وقم بتغطيتها بالغطاء ، وقم بتسخينها في فرن ميكروويف لمدة 2 × 8 دقائق بقوة 100٪.
- اترك الشرائح لتبرد في درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة (30-60 دقيقة). اغسل الشرائح 3 × 1 دقيقة بالماء المقطر المزدوج.
- تراجع الشرائح في محلول عمل المخزن المؤقت للغسيل لمدة 2 دقيقة. أداء حضانة الأجسام المضادة التالية.
- حضانة الأجسام المضادة التالية
- كرر الخطوات 3.2-3.8 (باستثناء الخطوة 3.7).
- تلطيخ الخلية النووية وختم الأنسجة
- قم بتغطية أقسام الأنسجة بمحلول عمل DAPI واحتضان الشرائح في غرفة مرطبة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح لمدة 3 × 2 دقيقة بالماء المقطر المزدوج.
- قم بإزالة قطرات الماء من الشرائح ، وأضف 10-20 ميكرولتر من المروي المضاد للتألق إلى كل شريحة ، وأغلق الشرائح بزجاج غطاء مجهري.
- تخزين الشرائح النهائية في 4 °C ، محمية من الضوء ، لأكثر من 1 شهر.
ملاحظة: احرص على تجنب فقاعات الهواء.
4. إعداد عنصر التحكم السلبي
- قم بمعالجة شرائح التحكم السلبية مثل الشرائح المحتوية على الأنسجة ولكن دون إضافة كواشف مثل الأجسام المضادة الأولية والأجسام المضادة الثانوية وكواشف TSA و DAPI ، والتي تستخدم لإزالة التألق الذاتي للأنسجة عند مسح الفيلم.
5. مسح تلقائي بالكامل لشرائح الأنسجة
ملاحظة: المعدات المستخدمة في التصوير الطيفي عبارة عن محلل تكميمي متعدد الأطياف مؤتمت بالكامل ، ويمكن إجراء تصوير وتحليل الشرائح ذات 5 ألوان باستخدام النظام المرجعي (انظر جدول المواد). يستخدم النظام التصوير متعدد الأطياف للخلط الكمي للفلوروفورات المتعددة والتألق الذاتي للأنسجة.
- اضبط وقت التعرض وبرنامج المسح يدويا لكل قناة مضان وتأكد من أن الأداة قد أكملت التعرض التلقائي بالكامل ومسح شرائح الأنسجة.
ملاحظة: يجب أن يكون سطح الشريحة نظيفا وخاليا من طبقة الماء. كن حذرا مع كمية مانع التسرب: سيؤدي الإفراط في انزلاق الغطاء وإبلاغ الأداة عن خطأ.
6. تحليل مضان
- انقر نقرا مزدوجا فوق البرنامج (انظر جدول المواد)، واسحب ملف الصورة الفلورية متعدد الألوان الذي تم الحصول عليه من المسح الضوئي الأصلي إلى البرنامج، واضبط نوع الصورة على مضان.
- انقر فوق زر السطوع والتباين وتحقق من القنوات الموجودة على اللوحة. انقر خارج ثم على القناة لتحديد قناة مضان الاهتمام. اسحب الحد الأدنى للعرض والعرض الأقصى لضبط السطوع والتباين لكل قناة.
- بعد التحليل ، حدد طريقة العرض المراد حفظها ، وانقر فوق إظهار نظرة عامة على الشريحة وإظهار موقع المؤشر لإزالة هذين المحتوىين ، واحتفظ بشريط المقياس ، وانقر فوق ملف | تصدير لقطة | محتوى المشاهد الحالي لتصدير ملف png.
ملاحظة: يجب تصدير كل قناة مضان ورقم مدمج للتحليل في المستقبل. - لمزيد من التحليل لإيجابية الخلية المستهدفة ، استخدم برنامج تحديد الخلايا وتجزئتها21 (انظر جدول المواد).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قمنا بتحسين مخطط المطابقة للأجسام المضادة الأولية CD8 والفلوروفور. تتوافق كلتا المجموعتين من نتائج التألق مع نفس ظروف حضانة الأجسام المضادة بالضبط في المجموعة التجريبية ، باستثناء التغيير في الفلوروفور المطابق للأجسام المضادة. كما هو موضح في الشكل 2 ، كان هناك اختلاف كبير في مطابقة القناة للخلايا التائية CD8 + مع الفلوروفور 480 والفلوروفور 690. تظهر القناة ذات الفلوروفور 690 خلفية فلورية قوية للغاية - تظهر المساحة الكبيرة من التألق الأحمر غير المنتظم داخل الدائرة الصفراء اللون ، مما يسبب تداخلا كبيرا في تحليل توطين خلايا CD8 + T (الشكل 2C ، D). ومع ذلك ، فإن القناة ذات الفلوروفور 480 تظهر إيجابية غشاء خلية CD8 محددة للغاية ولا توجد خلفية فلورية. وبالتالي ، تظهر الدوائر الصفراء غشاء خلية إيجابي واضح للغاية (الشكل 2 أ) ، والذي يوضح تماما أهمية مطابقة الأجسام المضادة والقنوات الفلورية في هذا البروتوكول.
تم فحص توزيع البلاعم والخلايا التائية السامة للخلايا في أنسجة سرطان الرئة الحرشفية ذات الخلايا غير الصغيرة ، وتم التحقق من التعبير عن البروتين المميز HMGCS1 في الخلايا السرطانية والخلايا المناعية. كما هو موضح في الشكل 3 ، تم اشتقاق الصور من QuPath 0.3.2. كانت لوحة mIHC عبارة عن فلوروفورات 480 و 520 و 620 و 690 و DAPI ، وكانت علامات الأجسام المضادة المقابلة هي CK5 / 6 ، وهي علامة لخلايا سرطان الرئة الحرشفية. CD8 ، علامة للخلايا التائية ؛ CD68 ، علامة للبلاعم ؛ و HMGCS1 ، وهو خاص بالخلايا السرطانية الإيجابية للبلازما. أظهرت البلاعم والخلايا التائية CD8 + تسللا كثيفا وتم توزيعها حول بؤر السرطان الحرشفية وداخلها ، بينما تم التعبير عن HMGCS1 على نطاق واسع في بلازما خلايا السرطان الحرشفية ، مما يدل على إيجابية قوية للخلايا السرطانية.
الشكل 1: سير عمل التلوين الكيميائي المناعي المتعدد لأنسجة FFPE. اختصار: FFPE = الفورمالين الثابت والبارافين جزءا لا يتجزأ منها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحسين بروتوكولات المطابقة ل CD8 والفلوروفور. كان هناك فرق كبير في مطابقة القناة للخلايا التائية CD8 + مع الفلوروفور 480 والفلوروفور 690. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تلطيخ كيميائي مناعي متعدد الإرسال في سرطان الرئة الحرشفي. توزيع البلاعم والخلايا التائية السامة للخلايا في أنسجة سرطان الرئة الحرشفية ذات الخلايا غير الصغيرة والتعبير عن البروتين المميز HMGCS1 في الخلايا السرطانية والخلايا المناعية. CK5 / 6 هو علامة لخلايا سرطان الرئة الحرشفية. CD8 هو علامة للخلايا التائية. CD68 هو علامة للبلاعم. و HMGCS1 خاص بالخلايا السرطانية الإيجابية للبلازما. قضبان المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| تقنية الكيمياء الهيستولوجية المناعية المتعددة | تقنية التألق المناعي التقليدية | ||||
| عدد الأهداف الجزيئية | غير محدود (ما يصل إلى 9 أنواع من الصباغة في وقت واحد ، بما في ذلك DAPI) | وضع العلامات العامة 3-4 أنواع (بما في ذلك DAPI) | |||
| الحصول على الصور | دقة تلطيخ عالية وخصوصية تلطيخ ، تضخيم الإشارات ، كثافة إشارة قوية ، وقت تبريد أطول ، بدون تأثير في الخلفية ، ونسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى بكثير في كل موقع مستهدف. | سطوع ضعيف ، تبريد سهل ، تأثير متبادل بين الأجسام المضادة المختلفة ، خلفية عالية | |||
| تحليل البيانات | خصوصية المنطقة ، تجزئة الخلايا ، المعلومات المكانية أحادية الخلية | المراقبة بالعين المجردة والقياس الكمي الدقيق بواسطة ImageJ | |||
الجدول 1: مقارنة بين تقنية التألق المناعي متعدد العلامات من أوبال وتقنية التألق المناعي التقليدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mIHC هي تقنية تجريبية لا غنى عنها في مجال البحث العلمي للتحليل الكمي والمكاني لعلامات البروتين المتعددة على مستوى الخلية الواحدة في قسم نسيج واحد ، مما يوفر بيانات بديهية ودقيقة لدراسة أمراض المرض من خلال التركيز على بنية الأنسجة التفصيلية والتفاعلات الخلوية في سياق الأنسجة الأصلية. سيتطلب اعتماد تكنولوجيا mIHC على نطاق واسع بروتوكولات تجريبية محسنة وفعالة. لمعالجة المشاكل التي قد تنشأ في التجارب ، نقدم الاعتبارات والحلول التالية.
أولا ، وفقا لمبدأ مطابقة المستضد والجسم المضاد المسمى بالفلوريسئين في تجارب متعددة الألوان ، يتطابق المستضد المعبر عنه بشكل ضعيف مع الجسم المضاد المسمى بالفلوريسئين بقوة ، ويتطابق المستضد المعبر عنه بقوة مع الجسم المضاد المسمى بالفلوريسئين الضعيف. بالاقتران مع نتائج تجارب IHC للمستضدات ذات العلامات أحادية الجسم المضاد ، يتم تحديد شدة التعبير عن البروتين المستهدف ، ويتم ضبط مطابقة الجسم المضاد والفلوريسئين ، وأخيرا تحديد مخطط مطابقة الجسم المضاد والفلوريسئين المطلوب في تجارب وضع العلامات متعددة الألوان. يمكن للقنوات الفلورية المجاورة ذات مستويات التعبير البروتيني المختلفة للجسم المضاد أن تحل مشكلة لون سلسلة قناة التألق المجاورة. ثانيا ، تم ضبط إعدادات البرنامج للكشف عن إشارات التألق باستخدام نظام التصوير Akoya Biosciences لتصوير الشرائح الملطخة ، وتم تعيين معلمات اكتساب التألق باستخدام برنامج المسح متعدد الأطياف Phenochart 1.0 ، والذي يسمح بالتحقق من توازن إشارة التألق22. يوصى بأن يكون وقت التعرض في حدود 100 مللي ثانية لقناة مضان واحدة ويجب أن يكون أكثر تجانسا ولا يزيد عن 200 مللي ثانية لقنوات مضان متعددة. يتم ضبط معلمات التألق بناء على ظروف حضانة الأجسام المضادة المحسنة IHC.
ثالثا ، يمكن تحليل مشكلة التألق الذاتي عن طريق تعيين عنصر تحكم فارغ ، جنبا إلى جنب مع الكشف الطيفي المميز للتصوير متعدد الأطياف. يمكن أن يحدد ذلك إشارات الألوان المختلطة ، وبالنسبة للعينات المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين ، يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء للصور بترتيب من حيث الحجم تقريبا عن طريق إزالة التألق الذاتي للأنسجة23. رابعا ، لمعالجة الكروموجينية غير المتخصصة في الأنسجة ، يجب استخدام الأجسام المضادة ذات خصوصية الأنسجة الضعيفة مع المصل غير المناعي الحيواني كمحلول مانع ، وعادة ما يضاف قبل الجسم المضاد الأساسي. عادة ما يكون نوع المصل المختار هو نفسه مصدر أنواع الأجسام المضادة الثانوية ، والتي يمكن أن تقلل من الكروموجينية غير المتخصصة. خامسا ، يوصى بإعداد ضوابط سلبية وضوابط إيجابية كضوابط جودة تجريبية. التحكم الإيجابي له دور التحقق من جودة الكواشف ، والتحكم السلبي له وظيفة مزدوجة للتحقق من جودة الإجراءات التجريبية وإزالة التألق الذاتي عند مسح الشرائح. يمكن استخدام المجموعة لضمان دقة كل تجربة. سادسا ، خطوة غسل الشرائح مهمة جدا طوال التجربة. يجب استخدام الكواشف المحضرة في البروتوكول ، ويجب استخدام وقت الغسيل لغسل الكواشف من الشرائح في كل خطوة لمنع التداخل مع الملصقات في الخطوة التالية.
عندما تكون خصوصية قناة مضان واحدة ضعيفة ، مما يؤدي إلى إيجابية غير محددة وتداخل مضان ، يجب على المستخدمين التحقق من نتيجة IHC للجسم المضاد المناسب ، وتأكيد النتيجة الإيجابية ، ثم التفكير في تغيير الفلوروفور ذي الصلة. إذا كانت نتيجة مضان إيجابية واحدة ضعيفة جدا أو قوية جدا ، فمن المهم إعادة تعيين معلمات مسح الفيلم إلى وقت التعرض للفلوروفور الموصى به من 10-150 مللي ثانية.
تقتصر طريقة وضع العلامات المتعددة هذه حاليا على عينات الأنسجة المضمنة بالبارافين ، حيث تتطلب عملية وضع العلامات على البروتين إصلاحات حرارية متعددة للمستضدات ، والتي تتطلب تثبيت الأنسجة لمنع الكسر. لن تتحمل الأجزاء المجمدة من الأنسجة الطازجة الضرر الناجم عن الإصلاح الحراري ، وستفقد كميات كبيرة من الأنسجة.
باختصار ، طريقة وضع العلامات على المستضد المتعدد في الموقع أقل استهلاكا للوقت ، مع وقت عملية وضع العلامات على الأجسام المضادة الواحدة أقل من 3 ساعات. فهو يجمع بين مزايا نظام التصوير متعدد الأطياف وبرنامج تحليل الأمراض الاحترافي لتحسين البروتوكول التجريبي mIHC من حيث ظروف وضع العلامات على البروتين الفردية وإعدادات المجموعة التجريبية والقناة الفلورية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن جميع المؤلفين أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا أعضاء معهد أبحاث علم الأمراض السريرية في مستشفى غرب الصين ، الذين ساهموا في التوجيه الفني لجودة التألق المناعي المتعدد ومعالجة IHC. تم دعم هذا البروتوكول من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82200078).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-CD8 | Abcam | ab237709 | Primary antibody, 1/100, PH9 |
| Anti-CD68 | Abcam | ab955 | Primary antibody, 1/300, PH9 |
| Anti-CK5/6 | Millipore | MAB1620 | Primary antibody, 1/150, PH9 |
| Anti-HMGCS1 | GeneTex | GTX112346 | Primary antibody, 1/300, PH6 |
| Animal nonimmune serum | MXB Biotechnologies | SP KIT-B3 | Antigen blocking |
| Fluormount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Anti-fluorescent burst |
| Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit | Akoya | NEL861001KT | Opal mIHC Staining |
| Wash Buffer | Dako | K8000/K8002/K8007/K8023 | Washing the tissues slides |
| Software | |||
| HALO | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| inForm | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| PerkinElmer Vectra | multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides. | ||
| QuPath 0.3.2 | intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment. |
References
- Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).
- Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).
- Nghiem, P. T., et al. PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).
- Zaretsky, J. M., et al. Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma. The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).
- Wang, C., et al. The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289 (2022).
- Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count. Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).
- Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development. Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Meany, D. L., Hackler, L. Jr, Zhang, H., Chan, D. W. Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).
- Surace, M., et al. Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390 (2019).
- Lazarus, J., et al. Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915 (2019).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Mansfield, J. R. Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated QUantitative Analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. QuPath: The global impact of an open source digital pathology system. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 852-859 (2021).
- Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 16878 (2017).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System. Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).
- Wilson, C. M., et al. Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data. Cancers. 13 (12), 3031 (2021).
- Mori, H., et al. Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).
- Mansfield, J. R. Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets. Methods. 52 (4), 271-280 (2010).
