Summary
Dit experimentele protocol beschrijft en optimaliseert een multiplex immunohistochemie (IHC) kleuringsmethode, voornamelijk door de incubatieomstandigheden van eenkanaals antilichamen te optimaliseren en de instellingen van antilichamen en kanalen aan te passen om de problemen van autofluorescentie en kanaaloverspraak in longkankerweefsels van klinische oorsprong op te lossen.
Abstract
Longkanker is de belangrijkste oorzaak van kwaadaardige tumorgerelateerde morbiditeit en mortaliteit over de hele wereld, en de complexe micro-omgeving van de tumor wordt beschouwd als de belangrijkste doodsoorzaak bij longkankerpatiënten. De complexiteit van de micro-omgeving van de tumor vereist effectieve methoden om cel-tot-celrelaties in tumorweefsels te begrijpen. De multiplex immunohistochemie (mIHC)-techniek is een belangrijk hulpmiddel geworden voor het afleiden van de relatie tussen de expressie van eiwitten stroomopwaarts en stroomafwaarts van signaalroutes in tumorweefsels en het ontwikkelen van klinische diagnoses en behandelplannen. mIHC is een multi-label immunofluorescentiekleuringsmethode op basis van Tyramine Signal Amplification (TSA)-technologie, die tegelijkertijd meerdere doelmoleculen op hetzelfde weefselsectiemonster kan detecteren om verschillende eiwitco-expressie en co-lokalisatieanalyse te bereiken. In dit experimentele protocol werden in paraffine ingebedde weefselsecties van plaveiselcelcarcinoom van klinische oorsprong onderworpen aan multiplex immunohistochemische kleuring. Door het experimentele protocol te optimaliseren, werd multiplex immunohistochemische kleuring van gelabelde doelcellen en eiwitten bereikt, waardoor het probleem van autofluorescentie en kanaaloverspraak in longweefsels werd opgelost. Bovendien wordt multiplex immunohistochemische kleuring veel gebruikt bij de experimentele validatie van tumorgerelateerde, high-throughput sequencing, waaronder single-cell sequencing, proteomics en weefselruimtesequencing, wat intuïtieve en visuele pathologievalidatieresultaten oplevert.
Introduction
Tyraminesignaalversterking (TSA), met een geschiedenis van meer dan 20 jaar, is een klasse van testtechnieken die mierikswortelperoxidase (HRP) gebruiken voor in-situ etikettering met hoge dichtheid van doelantigenen en wordt op grote schaal toegepast in enzymgekoppelde immunosorbenttests (ELISA's), in situ hybridisatie (ISH), immunohistochemie (IHC) en andere technieken voor de detectie van biologische antigenen, Aanzienlijke verbetering van de gevoeligheid van het gedetecteerde signaal1. Opaal polychromatische kleuring op basis van TSA-technologie is onlangs ontwikkeld en wordt veel gebruikt in verschillende onderzoeken 2,3,4,5. Traditionele immunofluorescentie (IF)-kleuring biedt onderzoekers een eenvoudig hulpmiddel voor de detectie en vergelijking van de verdeling van eiwitten in de cellen en weefsels van verschillende modelorganismen. Het is gebaseerd op antilichaam-/antigeenspecifieke binding en omvat directe en indirecte benaderingen6. Directe immunokleuring omvat het gebruik van een met fluorofoor geconjugeerd primair antilichaam tegen het betreffende antigeen, dat directe fluorescentiedetectie met behulp van een fluorescentiemicroscoop mogelijk maakt. De indirecte immunokleuringsbenadering omvat de toepassing van een fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam tegen het niet-geconjugeerde primaire antilichaam 6,7.
Traditionele, single-label, immunofluorescentiekleuringsmethoden kunnen slechts één, twee of in sommige gevallen drie antigenen in weefsels kleuren, wat een belangrijke beperking is bij het ontginnen van de rijke informatie in weefselsecties. De interpretatie van kwantitatieve resultaten is vaak afhankelijk van visuele waarneming en nauwkeurige kwantificering door beeldvormingssoftware, zoals ImageJ. Er zijn technische beperkingen, zoals beperking van antilichaamsoorten, zwakke fluorescerende labelsignalen en overlapping van fluorescerende kleurstofkleuren (tabel 1). De Opal multiplex IHC (mIHC)-techniek is gebaseerd op TSA-afleiding, die multiplexkleuring en differentiële etikettering van meer dan 7-9 antigenen op hetzelfde weefselgedeelte mogelijk maakt, zonder beperking van de oorsprong van het primaire antilichaam, maar vereist een hoge specificiteit van het overeenkomstige antilichaam tegen het antigeen. De kleuringsprocedure is vergelijkbaar met die van normale immunofluorescentiekleuring, met uitzondering van twee verschillen: bij elke kleuringsronde wordt slechts één antilichaam gebruikt en wordt een antilichaamelutiestap toegevoegd. Antilichamen die door niet-covalente bindingen aan het antigeen zijn gebonden, kunnen worden verwijderd door microgolfelutie, maar het TSA-fluorescerende signaal dat door covalente bindingen aan het oppervlak van het antigeen is gebonden, blijft behouden.
Geactiveerde tyramine (T)-moleculen die met de kleurstof zijn gelabeld, zijn sterk verrijkt bij het doelantigeen, waardoor het fluorescerende signaal efficiënt kan worden versterkt. Dit maakt directe etikettering van het antigeen mogelijk zonder interferentie van antilichamen, en vervolgens kan meerkleurige etikettering worden bereikt na meerdere kleuringscycli 8,9,10 (Figuur 1). Hoewel deze technologie betrouwbare en nauwkeurige beelden produceert voor de studie van ziekten, kan het creëren van een bruikbare multiplex fluorescerende immunohistochemie (mfIHC) kleuringsstrategie tijdrovend en veeleisend zijn vanwege de noodzaak van uitgebreide optimalisatie en ontwerp. Daarom is dit multiplex paneelprotocol geoptimaliseerd in een geautomatiseerde IHC-stainer met een kortere kleurtijd dan die van het handmatige protocol. Deze aanpak kan door elke onderzoeker direct worden toegepast en aangepast voor immuno-oncologische studies op menselijke formaline-gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters11. Bovendien zullen de methoden voor preparaatheid van objectglaasjes, optimalisatie van antilichamen en multiplexontwerp nuttig zijn bij het verkrijgen van robuuste beelden die nauwkeurige cellulaire interacties in situ weergeven en om de optimalisatieperiode voor handmatige analyse te verkorten12.
De mfIHC omvat voornamelijk beeldacquisitie en data-analyse. In termen van beeldacquisitie moeten meerkleurig gelabelde complex-gekleurde monsters worden gedetecteerd met professionele spectrale beeldvormingsapparatuur om de verschillende gemengde kleursignalen te identificeren en hoge signaal-ruisbeelden te verkrijgen zonder interferentie van autofluorescentie van weefsels. De huidige apparatuur voor spectrale beeldvorming omvat voornamelijk spectrale confocale microscopen en multispectrale weefselbeeldvormingssystemen. Het multispectrale weefselbeeldvormingssysteem is een professioneel beeldvormingssysteem dat is ontworpen voor de kwantitatieve analyse van weefselsecties, en het belangrijkste kenmerk is de verwerving van spectrale beeldinformatie, die zowel morfologische structuur als optische mapping-informatie van biologische weefselmonsters biedt13,14. Elke pixel in het spectrale beeld bevat een volledige spectrale curve en elke kleurstof (inclusief autofluorescentie) heeft het bijbehorende karakteristieke spectrum, waardoor de volledige registratie en nauwkeurige identificatie van gemengde en overlappende multilabel-signalen mogelijk is.
In termen van data-analyse zijn veelkleurig gelabelde monsters uiterst complex vanwege de morfologische structuur en samenstellende cellen van de weefselmonsters. Gewone software kan niet automatisch verschillende weefseltypes identificeren. Daarom wordt intelligente kwantitatieve weefselanalysesoftware gebruikt voor kwantitatieve analyse van antigeenexpressie in specifieke regio's 15,16,17,18.
Bovenal heeft multilabel immunofluorescentiekleuring gefuseerd met multispectrale beeldvorming en kwantitatieve pathologie-analysetechnologie de voordelen van een groot aantal detectiedoelen, effectieve kleuring en nauwkeurige analyse, en kan daarom de nauwkeurigheid van histomorfologische analyse aanzienlijk verbeteren, de ruimtelijke relatie tussen eiwitten met resolutie op cellulair niveau onthullen en helpen om rijkere en betrouwbaardere informatie uit weefselsectiemonsterste halen 19 (Tabel 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol is goedgekeurd door de richtlijnen van de ethische commissie van het West China Hospital, Sichuan University, China. De longkankerweefselmonsters werden verkregen tijdens een operatie in het Centrum voor Longkanker in het West China Hospital en van elke patiënt werd geïnformeerde toestemming verkregen.
1. Voorbereiding van de weefselsectie
- FFPE-voorbereiding
- Dompel klinische weefsels gedurende meer dan 72 uur onder in een neutrale formaline-oplossing.
- Voltooi het proces van het uitdrogen van de weefsels met xyleen en gesorteerde alcoholische oplossingen20.
- Voer handmatige paraffine-inbedding en weefselsecties uit bij een sectiedikte van 4 μm. Gebruik adhesiemicroscoopglaasjes om ervoor te zorgen dat de plakjes weefsel er niet uit vallen.
- Bak de glaasjes 2 uur in een oven op 65 °C om ervoor te zorgen dat het zakdoekje en de glaasjes droog zijn. Bewaar in een glaasjesdoos bij kamertemperatuur.
- Voorbehandeling van weefselsecties
- Behandel de weefselglaasjes gedurende 5 minuten in een oven bij 65 °C en dompel ze vervolgens achtereenvolgens gedurende 2 x 15 minuten onder in xyleenoplossingen, 2 x 15 minuten watervrije ethanoloplossingen, 10 minuten 90% ethanoloplossing, 10 minuten 85% ethanoloplossing, 10 minuten 80% ethanoloplossing en 10 minuten 75% ethanoloplossing, gevolgd door het wassen van de glaasjes met gesteriliseerd water gedurende 3 x 1 min.
OPMERKING: Deze experimentele techniek kan alleen worden gebruikt voor FFPE-weefsel, niet voor bevroren of vers weefsel, omdat het meervoudige antigeenherstelproces bij hoge temperatuur ervoor zorgt dat het weefsel van het objectglaasje valt.
- Behandel de weefselglaasjes gedurende 5 minuten in een oven bij 65 °C en dompel ze vervolgens achtereenvolgens gedurende 2 x 15 minuten onder in xyleenoplossingen, 2 x 15 minuten watervrije ethanoloplossingen, 10 minuten 90% ethanoloplossing, 10 minuten 85% ethanoloplossing, 10 minuten 80% ethanoloplossing en 10 minuten 75% ethanoloplossing, gevolgd door het wassen van de glaasjes met gesteriliseerd water gedurende 3 x 1 min.
2. Optimalisatie van primair antilichaam
OPMERKING: Conventionele IHC-experimenten werden gebruikt om de incubatieomstandigheden voor individuele antilichamen te bepalen, voornamelijk inclusief antilichaamconcentratie en antigeenherstelcondities. Raadpleeg de voorwaarden in de gebruiksaanwijzing van het antilichaam.
- Gebruik een antilichaamconcentratie die iets hoger is dan het aanbevolen concentratiebereik en tussenliggende waarden.
- Optimaliseer de bufferroutines voor het ophalen van antigeen PH6 en PH9 op basis van de locatie van eiwitexpressie. Gebruik PH9 voor eiwitten die tot expressie komen in de kern en gebruik routine (PH6 of PH9) voor andere eiwitten.
3. mIHC-kleuringsmethode
OPMERKING: Opaal mIHC-kleuring is een van de beschikbare mIHC-methoden. In dit experimentele 5-kleurenprotocol, aangezien elk weefselmonster moet worden gekleurd met vier antilichamen, zijn vier primaire antilichaamincubaties, secundaire antilichaamincubaties en TSA-signaalamplificatie chromogene incubaties nodig, evenals vijf antigeenrestauraties. Ten slotte worden 4'6-diamidino-2-fenylindool (DAPI)-kleuring en antifluorescerende barstmiddelafdichting uitgevoerd.
- Bereiding van het belangrijkste reagens
OPMERKING: Bepaal de hoeveelheid reagens die moet worden toegevoegd op basis van de grootte van de weefselglaasjes. Gebruik voldoende volume om het weefselgedeelte volledig te bedekken (over het algemeen 50-150 μL per objectglaasje). De werkoplossingen die nodig zijn voor het experiment worden als volgt voorbereid:- Wasbuffer werkoplossing: 20x wasbuffer verdunnen op 1:20 met dubbel gedestilleerd water, en bewaren bij kamertemperatuur.
- PH6 buffer werkoplossing: Verdun 100x PH6 buffer op 1:100 met dubbel gedestilleerd water. Voorbereiden voor gebruik en bewaren bij kamertemperatuur.
- PH9 buffer werkoplossing: Verdun 50x PH9 buffer op 1:50 met dubbel gedestilleerd water. Voorbereiden voor gebruik en bewaren bij kamertemperatuur.
- Polymeer HRP: Bereid deze kant-en-klare oplossing alleen voor primaire antilichamen van konijnen- en muizenoorsprong.
- Fluorofoor werkoplossing: Reconstitueer elk fluorofoorpoeder (behalve fluorofoor 780) in 75 μL DMSO. Verdun voor elke procedure de fluorofoor in 1x amplificatieverdunningsmiddel op 1:100. Gooi elk ongebruikt deel van de fluorofoor-werkoplossing weg.
- Fluorofoor 780 werkoplossing: Reconstitueer TSA-DIG in 75 μL DMSO en het fluorofoorpoeder 780 in 300 μL dubbel gedestilleerd water. Verdun vóór de procedure TSA-DIG in 1x amplificatieverdunningsmiddel bij 1:100 en verdun fluorofoor 780 met Ab-verdunningsmiddel bij 1:25.
- DAPI-werkoplossing: Verdun de DAPI-oplossing bij 1:50 met dubbel gedestilleerd water of PBS. Voor gebruik voorbereiden en niet langer dan 48 uur bij 4 °C bewaren.
NOTITIE. Was de objectglaasjes alleen met dubbel gedestilleerd water en vers bereide wasbuffer-werkoplossing tijdens dit multilabel-fluorescentiekleuringsexperiment. Weefselsecties mogen niet in contact komen met leidingwater; Verontreinigingen in het leidingwater kunnen zich hechten aan de weefselsecties en autofluorescentie veroorzaken. Houd de monsters tijdens het experiment uit de buurt van licht.
- Antigeen ophalen
- Plaats de objectglaasjes in een kleur- en reparatiedoos en vul deze met PH6 of PH9 bufferwerkoplossing, dek af met het deksel en verwarm in een magnetron gedurende 2 x 8 minuten op 100% vermogen.
NOTITIE: Voeg tijdens het verwarmingsproces dubbel gedestilleerd water toe aan de reparatiedoos om overmatige verdamping te voorkomen waardoor de plakjes kunnen uitdrogen. - Laat de glaasjes afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat (30-60 min).
- Was de glaasjes 3 x 2 min met dubbel gedestilleerd water. Gebruik een hydrofobe barrièrepen om het weefselgedeelte op het objectglaasje te omcirkelen.
- Plaats de objectglaasjes in een kleur- en reparatiedoos en vul deze met PH6 of PH9 bufferwerkoplossing, dek af met het deksel en verwarm in een magnetron gedurende 2 x 8 minuten op 100% vermogen.
- Blokkeren
- Dompel weefselsecties onder in wasbuffer, dek af met blokkeeroplossing en incubeer objectglaasjes gedurende 10 minuten in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur.
- Primaire incubatie van antilichamen
- Verwijder de blokkerende oplossing van de objectglaasjes en bedek de weefselsecties met de primaire antilichaamwerkoplossing. Incubeer de objectglaasjes in een bevochtigde kamer gedurende 1 uur bij 37 °C in de incubator of een nacht bij 4 °C in de koelkast.
NOTITIE: Laat de glaasjes niet uitdrogen.
- Verwijder de blokkerende oplossing van de objectglaasjes en bedek de weefselsecties met de primaire antilichaamwerkoplossing. Incubeer de objectglaasjes in een bevochtigde kamer gedurende 1 uur bij 37 °C in de incubator of een nacht bij 4 °C in de koelkast.
- Introductie van polymeer HRP
- Was de objectglaasjes in de wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 min. Voeg polymeer HRP direct druppelsgewijs toe aan weefselsecties en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
NOTITIE: Voor objectglaasjes die in de koelkast worden bewaard, bewaar ze ongeveer 30 minuten op kamertemperatuur voordat u ze wast om het primaire antilichaam te verwijderen.
- Was de objectglaasjes in de wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 min. Voeg polymeer HRP direct druppelsgewijs toe aan weefselsecties en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Genereren van tyraminesignaalversterking (TSA)
- Was het glaasje met wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 minuten, voeg fluorofoor werkoplossing direct druppelsgewijs toe aan de weefselsecties en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was het glaasje met wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 min.
- Speciale procedure voor fluorofoor 780
OPMERKING: Fluorofoor 780 is zwak en wordt routinematig als laatste geplaatst in het kleurafstemmingsschema van het hele experiment. Fluorofoor 780 wordt normaal gesproken niet gebruikt in dit experimentele protocol, maar vanwege zijn specificiteit worden de experimentele stappen vermeld.- Introductie van TSA-DIG
- Was het glaasje met wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 minuten, voeg TSA-Drg-werkoplossing druppelsgewijs toe aan de weefselsecties en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Microgolf-behandeling
- Was de objectglaasjes met wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 min.
- Plaats de glaasjes in een kleur- en reparatiedoos, vul deze met reparatieoplossing, dek af met het deksel en verwarm in een magnetron gedurende 2 x 8 minuten op 100% vermogen. Laat de glaasjes afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat (30-60 min).
- Was de glijbanen 3 x 2 min met dubbel gedestilleerd water.
- Fluorofoor 780 signaalgeneratie
- Dompel de secties onder in een wasbuffer, bedek ze met fluorofoor 780 werkoplossing en incubeer de objectglaasjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
- Was de objectglaasjes met wasbuffer werkoplossing gedurende 3 x 2 min.
OPMERKING: Voer na deze stap GEEN microgolfbehandeling uit.
- Gebruik fluorofoor 780 als laatste stap van de gehele workflow en kleur vervolgens kernen rechtstreeks met de DAPI-werkoplossing.
NOTITIE: Sla stap 3.7 over als u geen fluorofoor 780 gebruikt.
- Introductie van TSA-DIG
- Microgolf-behandeling
OPMERKING: Deze microgolfstap stript het primaire-secundaire HRP-complex en legt antigenen opnieuw bloot, waardoor de introductie van het volgende primaire antilichaam mogelijk wordt.- Plaats de objectglaasjes in een kleur- en reparatiedoos, vul deze met PH6 of PH9 bufferwerkoplossing, dek af met het deksel en verwarm in een magnetron gedurende 2 x 8 minuten op 100% vermogen.
- Laat de glaasjes afkoelen tot kamertemperatuur voordat u verder gaat (30-60 min). Was de glaasjes 3 x 1 min met dubbel gedestilleerd water.
- Dompel de glaasjes gedurende 2 minuten in de wasbuffer werkoplossing. Voer de volgende incubatie van antilichamen uit.
- Volgende incubatie van antilichamen
- Herhaal stap 3.2-3.8 (behalve stap 3.7).
- Celnucleaire kleuring en weefselafdichting
- Bedek de weefselsecties met de DAPI-werkoplossing en incubeer de objectglaasjes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer. Was de glijbanen 3 x 2 min met dubbel gedestilleerd water.
- Verwijder waterdruppels van de objectglaasjes, voeg 10-20 μL antifluorescentiebluser toe aan elk glaasje en sluit de glaasjes af met een microscoopafdekglas.
- Bewaar de afgewerkte objectglaasjes langer dan 1 maand bij 4 °C, beschermd tegen licht.
NOTITIE: Zorg ervoor dat u geen luchtbellen krijgt.
4. Stel de negatieve controle in
- Verwerk de negatieve controleglaasjes zoals de weefselbevattende objectglaasjes, maar zonder toevoeging van reagentia zoals primaire antilichamen, secundaire antilichamen, TSA-reagentia en DAPI, die worden gebruikt om weefselautofluorescentie te verwijderen bij het scannen van de film.
5. Volautomatisch scannen van weefselglaasjes
OPMERKING: De apparatuur die wordt gebruikt voor spectrale beeldvorming is een volledig geautomatiseerde multispectrale weefselkwantificeringsanalysator, en beeldvormings- en analysevisualisatie van 5-kleurenobjectglaasjes kan worden uitgevoerd met behulp van het systeem waarnaar wordt verwezen (zie Materiaaltabel). Het systeem maakt gebruik van multispectrale beeldvorming voor het kwantitatief ontmengen van meerdere fluoroforen en weefselautofluorescentie.
- Stel handmatig de belichtingstijd en het scanprogramma in voor elk fluorescentiekanaal en bevestig dat het instrument de volautomatische belichting en het scannen van de weefselglaasjes heeft voltooid.
NOTITIE: Het oppervlak van de dia moet schoon en vrij van waterfilm zijn. Wees voorzichtig met de hoeveelheid sealer: te veel zal ervoor zorgen dat het dekglaasje wegglijdt en het instrument een fout meldt.
6. Analyse van fluorescentie
- Dubbelklik op de software (zie de Materiaaltabel), sleep het meerkleurige fluorescentiebeeldbestand dat u van de originele scan hebt verkregen naar de software en stel het afbeeldingstype in op fluorescentie.
- Klik op de knop Helderheid en contrast en controleer de kanalen op het paneel. Klik buiten en vervolgens op het kanaal om het gewenste fluorescentiekanaal te selecteren. Sleep de Min-weergave en de Max-weergave om de helderheid en het contrast van elk kanaal aan te passen.
- Bepaal na analyse de weergave die moet worden opgeslagen, klik op Diaoverzicht weergeven en Cursorlocatie weergeven om deze twee inhoud te verwijderen, de schaalbalk behouden en klik op Bestand | Momentopname exporteren | Huidige viewerinhoud om een png-bestand te exporteren.
OPMERKING: Elk fluorescentiekanaal en een samengevoegd cijfer moeten worden geëxporteerd voor toekomstige analyse. - Gebruik voor verdere analyse van de positiviteit van doelcellen celidentificatie- en segmentatiesoftware21 (zie Materiaaltabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben het matchingschema van CD8 primaire antilichamen en fluoroforen geoptimaliseerd. Beide sets fluorescentieresultaten kwamen overeen met exact dezelfde incubatieomstandigheden van antilichamen in de experimentele groep, behalve de verandering in de antilichaam-gematchte fluorofoor. Zoals te zien is in figuur 2, was er een significant verschil in de kanaalmatching van CD8+ T-cellen met fluorofoor 480 en fluorofoor 690. Het kanaal met fluorofoor 690 vertoont een extreem sterke fluorescerende achtergrond - het grote gebied van rode onregelmatige fluorescentie binnen de gele cirkel vertoont kleur, wat grote interferentie veroorzaakt in de lokalisatieanalyse van CD8+ T-cellen (Figuur 2C,D). Het kanaal met fluorofoor 480 vertoont echter een zeer specifieke CD8-celmembraanpositiviteit en geen fluorescerende achtergrond. De gele cirkels tonen dus een zeer duidelijk positief celmembraan (Figuur 2A), wat het belang van antilichaam- en fluorescentiekanaalafstemming in dit protocol volledig illustreert.
De verdeling van macrofagen en cytotoxische T-cellen werd onderzocht in niet-kleincellige plaveiselcelcarcinoomweefsels van de longen, en de expressie van het karakteristieke eiwit HMGCS1 in tumorcellen en immuuncellen werd geverifieerd. Zoals te zien is in figuur 3, zijn de afbeeldingen afgeleid van QuPath 0.3.2. Het mIHC-panel bestond uit fluoroforen 480, 520, 620, 690 en DAPI, en de overeenkomstige antilichaammarkers waren CK5/6, een marker voor plaveiselcelcellen in de longen; CD8, een marker voor T-cellen; CD68, een marker voor macrofagen; en HMGCS1, dat specifiek is voor plasma-positieve tumorcellen. Macrofagen en CD8+ T-cellen vertoonden zware infiltratie en waren verspreid rond en in de plaveiselcelcarcinoomhaarden, terwijl HMGCS1 op grote schaal tot expressie werd gebracht in het plaveiselcelplasma, wat een sterke positiviteit van de tumorcel vertoonde.
Figuur 1: De workflow van multiplex immunohistochemische kleuring voor FFPE-weefsel. Afkorting: FFPE = formaline-gefixeerd en paraffine-embedded. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Optimalisatie van de matchingprotocollen voor CD8 en fluoroforen. Er was een significant verschil in de kanaalmatching van CD8+ T-cellen met fluorofoor 480 en fluorofoor 690. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Meervoudige immunohistochemische kleuring bij plaveiselcelcarcinoom van de longen. De verdeling van macrofagen en cytotoxische T-cellen in niet-kleincellige plaveiselcelcarcinoomweefsels van de longen en de expressie van het karakteristieke eiwit HMGCS1 in tumorcellen en immuuncellen. CK5/6 is een marker voor plaveiselcelcarcinoom in de longen; CD8 is een marker voor T-cellen; CD68 is een marker voor macrofagen; en HMGCS1 is specifiek voor plasma-positieve cellen van tumorcellen. Schaalbalken = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Multiplex Immunohistochemie techniek | Traditionele immunofluorescentietechniek | ||||
| Aantal moleculaire doelwitten | Onbeperkt (tot 9 soorten verven tegelijk, inclusief DAPI) | Algemene markering 3-4 soorten (inclusief DAPI) | |||
| Acquisitie van afbeeldingen | Hoge kleuringsresolutie en kleuringsspecificiteit, signaalversterking, sterke signaalintensiteit, langere blustijd, geen achtergrondeffect en een veel hogere signaal-ruisverhouding op elke doellocatie. | Zwakke helderheid, gemakkelijk afschrikken, wederzijdse beïnvloeding tussen verschillende antilichamen, hoge achtergrond | |||
| Data-analyse | Gebiedsspecificiteit, celsegmentatie, ruimtelijke informatie over één cel | Waarneming met het blote oog en nauwkeurige kwantificering door ImageJ | |||
Tabel 1: Vergelijking tussen Opal multi-labeling immunofluorescentietechnologie en traditionele immunofluorescentietechnologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
mIHC is een onmisbare experimentele techniek op het gebied van wetenschappelijk onderzoek voor de kwantitatieve en ruimtelijke analyse van meerdere eiwitmarkers op het niveau van één cel in een enkele weefselsectie, die intuïtieve en nauwkeurige gegevens oplevert voor de studie van ziektepathologie door zich te concentreren op de gedetailleerde weefselstructuur en cellulaire interacties in de context van het oorspronkelijke weefsel. De wijdverbreide acceptatie van mIHC-technologie vereist geoptimaliseerde en effectieve experimentele protocollen. Om de problemen aan te pakken die zich in de experimenten kunnen voordoen, presenteren we de volgende overwegingen en oplossingen.
Ten eerste, volgens het principe van het matchen van antigeen en fluoresceïne-gelabeld antilichaam in meerkleurige experimenten, wordt zwak tot expressie gebracht antigeen gekoppeld aan sterk fluoresceïne-gelabeld antilichaam, en sterk tot expressie gebracht antigeen wordt gecombineerd met zwak fluoresceïne-gelabeld antilichaam. Gecombineerd met de resultaten van IHC-experimenten van enkelvoudig antilichaam-gelabelde antigenen, wordt de intensiteit van expressie van het doeleiwit bepaald en wordt de afstemming van antilichaam en fluoresceïne aangepast, waardoor uiteindelijk het matchingschema van antilichaam en fluoresceïne wordt bepaald dat vereist is in meerkleurige labelexperimenten. Aangrenzende fluorescentiekanalen met verschillende eiwitexpressieniveaus van het antilichaam kunnen het probleem van de aangrenzende kleur van de fluorescentiekanaalreeks oplossen. Ten tweede werden de software-instellingen voor het detecteren van fluorescentiesignalen ingesteld met behulp van het Akoya Biosciences-beeldvormingssysteem voor het afbeelden van gekleurde objectglaasjes, en werden de fluorescentie-acquisitieparameters ingesteld met behulp van de multispectrale scansoftware Phenochart 1.0, waarmee de fluorescentiesignaalbalans22 kan worden gecontroleerd. Aanbevolen wordt de blootstellingstijd voor één fluorescentiekanaal binnen 100 ms te houden en homogener te zijn en niet langer dan 200 ms voor meerdere fluorescentiekanalen. De fluorescentieparameters worden aangepast op basis van de IHC-geoptimaliseerde incubatieomstandigheden van antilichamen.
Ten derde kan het probleem van autofluorescentie worden geanalyseerd door een blanco regeling in te stellen, gecombineerd met de karakteristieke spectrale detectie van multispectrale beeldvorming. Dit kan de gemengde kleursignalen identificeren en, voor in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde monsters, de signaal-ruisverhouding van de beelden met ongeveer een orde van grootte verbeteren door weefselautofluorescentiete verwijderen 23. Ten vierde, om weefsel-niet-specifieke chromogeniciteit aan te pakken, moeten antilichamen met een slechte weefselspecificiteit worden gebruikt met dierlijk niet-immuunserum als een blokkerende oplossing, meestal toegevoegd vóór het primaire antilichaam. De geselecteerde serumsoort is over het algemeen dezelfde als de bron van de secundaire antilichaamsoort, wat de niet-specifieke chromogeniciteit kan verminderen. Ten vijfde wordt aanbevolen om negatieve en positieve controles in te stellen als experimentele kwaliteitscontroles. De positieve controle heeft tot taak de kwaliteit van de reagentia te controleren en de negatieve controle heeft de dubbele functie van het verifiëren van de kwaliteit van de experimentele procedures en het verwijderen van autofluorescentie bij het scannen van objectglaasjes. De combinatie kan worden gebruikt om de nauwkeurigheid van elk experiment te garanderen. Ten zesde is de stap voor het wassen van dia's erg belangrijk tijdens het experiment. De reagentia die in het protocol zijn voorbereid, moeten worden gebruikt en de wastijd moet worden gebruikt om de reagentia bij elke stap van de objectglaasjes te wassen om interferentie met de etikettering in de volgende stap te voorkomen.
Wanneer de specificiteit van een enkel fluorescentiekanaal slecht is, wat resulteert in niet-specifieke positiviteit en fluorescentie-overspraak, moeten gebruikers het IHC-resultaat van het juiste antilichaam controleren, het positieve resultaat bevestigen en vervolgens overwegen de relevante fluorofoor te vervangen. Als een enkel positief fluorescentieresultaat te zwak of te sterk is, is het belangrijk om de filmscanparameters terug te zetten naar de aanbevolen fluorofoorbelichtingstijd van 10-150 ms.
Deze meervoudige etiketteringsmethode is momenteel beperkt tot in paraffine ingebedde weefselmonsters, aangezien het eiwitetiketteringsproces meerdere antigene thermische reparaties vereist, waarbij het weefsel moet worden gefixeerd om breuk te voorkomen. Bevroren delen van vers weefsel zijn niet bestand tegen de schade veroorzaakt door thermisch herstel en grote hoeveelheden weefsel zullen verloren gaan.
Samenvattend is deze meervoudige antigeen in situ labelmethode minder tijdrovend, met een enkele antilichaamlabelingsprocestijd van minder dan 3 uur. Het combineert de voordelen van een multispectraal beeldvormingssysteem en professionele pathologie-analysesoftware om het experimentele mIHC-protocol te optimaliseren in termen van individuele eiwitetiketteringsomstandigheden en experimentele groeps- en fluorescentiekanaalinstellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenconflicten.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de leden van het Clinical Pathology Research Institute West China Hospital erkennen, die technische begeleiding hebben bijgedragen voor hoogwaardige multiplex immunofluorescentie en IHC-verwerking. Dit protocol werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82200078).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Anti-CD8 | Abcam | ab237709 | Primary antibody, 1/100, PH9 |
| Anti-CD68 | Abcam | ab955 | Primary antibody, 1/300, PH9 |
| Anti-CK5/6 | Millipore | MAB1620 | Primary antibody, 1/150, PH9 |
| Anti-HMGCS1 | GeneTex | GTX112346 | Primary antibody, 1/300, PH6 |
| Animal nonimmune serum | MXB Biotechnologies | SP KIT-B3 | Antigen blocking |
| Fluormount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Anti-fluorescent burst |
| Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit | Akoya | NEL861001KT | Opal mIHC Staining |
| Wash Buffer | Dako | K8000/K8002/K8007/K8023 | Washing the tissues slides |
| Software | |||
| HALO | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| inForm | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| PerkinElmer Vectra | multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides. | ||
| QuPath 0.3.2 | intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment. |
References
- Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).
- Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).
- Nghiem, P. T., et al. PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).
- Zaretsky, J. M., et al. Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma. The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).
- Wang, C., et al. The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289 (2022).
- Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count. Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).
- Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development. Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).
- Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
- Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
- Meany, D. L., Hackler, L. Jr, Zhang, H., Chan, D. W. Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).
- Surace, M., et al. Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390 (2019).
- Lazarus, J., et al. Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915 (2019).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Mansfield, J. R. Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).
- Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated QUantitative Analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
- Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
- Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. QuPath: The global impact of an open source digital pathology system. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 852-859 (2021).
- Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 16878 (2017).
- Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
- Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System. Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).
- Wilson, C. M., et al. Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data. Cancers. 13 (12), 3031 (2021).
- Mori, H., et al. Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).
- Mansfield, J. R. Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets. Methods. 52 (4), 271-280 (2010).
