Summary
mScarlet adı verilen bir floresan proteini kullanarak Epon gömme sonrası bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyabilir. Bu teknik, çok çeşitli biyolojik uygulamalara uygundur.
Abstract
Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), floresan mikroskobu (FM) tarafından sağlanan lokalizasyon bilgilerini ve elektron mikroskobu (EM) tarafından elde edilen hücresel üst yapı bağlamını birleştiren kapsamlı bir mikroskopidir. CLEM, floresan ve üst yapı arasında bir değiş tokuştur ve genellikle üst yapı floresansı tehlikeye atar. Glisidil metakrilat, HM20 veya K4M gibi diğer hidrofilik gömme reçineleri ile karşılaştırıldığında, Epon, üst yapı koruma ve kesit alma özelliklerinde üstündür. Daha önce, mEosEM'nin osmiyum tetroksit fiksasyonuna ve Epon gömülmesine dayanabileceğini göstermiştik. mEosEM'i kullanarak, ilk kez, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyan Epon post gömme CLEM'i elde ettik. Burada, EM numune hazırlama, FM görüntüleme, EM görüntüleme ve görüntü hizalama hakkında adım adım ayrıntılar sunuyoruz. Ayrıca, EM görüntüleme sırasında FM görüntüleme ile görüntülenen aynı hücreyi tanımlama prosedürlerini iyileştiriyoruz ve FM ve EM görüntüleri arasındaki kaydı detaylandırıyoruz. Geleneksel EM tesislerinde bu yeni protokolü takiben Epon post gömülü bağıntılı ışık ve elektron mikroskobunun kolayca elde edilebileceğine inanıyoruz.
Introduction
Floresan mikroskobu (FM), hedef proteinin lokalizasyonunu ve dağılımını elde etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, hedef proteini çevreleyen bağlam kaybolur, bu da hedef proteini iyice araştırmak için çok önemlidir. Elektron mikroskobu (EM), birkaç hücre altı ayrıntı sağlayan en yüksek görüntüleme çözünürlüğüne sahiptir. Bununla birlikte, EM hedef etiketlemeden yoksundur. FM tarafından alınan floresan görüntüsünü EM tarafından elde edilen gri görüntü ile doğru bir şekilde birleştirerek, bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), bu iki görüntüleme modu 1,2,3,4 tarafından elde edilen bilgileri birleştirebilir.
CLEM, floresan ve üst yapı1 arasında bir değiş tokuştur. Mevcut floresan proteinlerin sınırlamaları ve geleneksel EM numune hazırlama prosedürleri, özellikle osmik asit (OsO4) ve Epon gibi hidrofobik reçinelerin kullanımı nedeniyle, üst yapı her zaman floresan5'i tehlikeye atar. OsO4 , EM görüntülerinin kontrastını iyileştirmek için kullanılan EM numune hazırlamada vazgeçilmez bir reaktiftir. Diğer gömme reçineleri ile karşılaştırıldığında, Epon ultrastrüktür koruma ve kesit alma özelliklerinde üstündür5. Bununla birlikte, hiçbir floresan proteini,OSo4 ve Epon gömme6'nın tedavisinden sonra floresan sinyalini tutamaz. Floresan proteinlerin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, EM numune hazırlamadan önce FM görüntülemenin yapıldığı önceden gömülü CLEM geliştirilmiştir6. Bununla birlikte, CLEM'i önceden gömmenin dezavantajı, FM ve EM görüntüleri arasındaki kesin olmayan kayıttır5.
Aksine, gömme sonrası CLEM yöntemi, kayıt doğruluğu 6-7 nm 5,6'ya ulaşabilen EM numune hazırlığından sonra FM görüntülemeyi gerçekleştirir. Floresan proteinlerin floresansını korumak için, çok düşük konsantrasyonlarda OsO4 (% 0.001)3 veya yüksek basınçlı dondurulmuş (HPF) ve dondurarak ikame (FS) EM hazırlama yöntemleri 4,7, bozulmuş üst yapı veya EM görüntüsünün kontrastı pahasına kullanılmıştır. Gömme reçinesi5 olarak glisidil metakrilat kullanılmasına rağmen, mEos4b'nin geliştirilmesi, gömme sonrası CLEM'in ilerlemesini büyük ölçüde destekler. OsO4 boyama ve Epon gömme hayatta kalabilen mEosEM'in geliştirilmesiyle, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyarak ilk kez Epon gömme sonrası süper çözünürlüklü CLEM elde edildi6. mEosEM'den sonra,OsO4 boyamaya ve Epon gömmeye dayanabilen birkaç floresan proteini geliştirildi 8,9,10,11. Bu, CLEM'in gelişimini büyük ölçüde teşvik eder.
Epon gömme sonrası CLEM'in üç temel yönü vardır. Birincisi, EM numune hazırlığından sonra floresan sinyalini koruması gereken floresan proteindir. Deneyimlerimize göre, mScarlet bildirilen diğer floresan proteinlerden üstündür. İkincisi, EM görüntülemede FM görüntüleme ile görüntülenen aynı hücrenin nasıl bulunacağıdır. Bu sorunu çözmek için, hedeflenen hücreyi kolayca bulabilmeniz için bu adımın prosedürünü iyileştiriyoruz. Sonuncusu, FM görüntüsünü EM görüntüsüyle hizalama yöntemidir. Burada, FM ve EM görüntüleri arasındaki kaydı detaylandırıyoruz. Bu protokolde, VGLUT2 nöronlarında mScarlet'i eksprese ediyoruz ve mScarlet'in Epon post-embedding CLEM kullanarak ikincil lizozomları hedefleyebileceğini gösteriyoruz. Floresan ve üst yapıdan ödün vermeden Epon gömme sonrası CLEM için adım adım ayrıntılar sunuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvancılık ve deneyler, Fujian Tıp Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Geçerli protokolün adım adım iş akışı Şekil 1'de gösterilmektedir.
1. Numune hazırlama
- Fare beyni
- Bu fareleri genotiplemek için transgenik fareler (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oligonükleotid primerleri (Malzeme Tablosuna bakınız) satın alın.
- Daha önce yayınlanmış protokol 12,13'ü izleyerek sağlam beyni kraniyal tonozdan perfüze edin ve çıkarın.
- Fare beynini gece boyunca 4 °C'de 10 mL fiksatif solüsyon ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak sabitleyin.
- Fiksatif çözeltiyi 0,1 M fosfat tamponu (PB) ile 3 x 10 dakika durulayın.
- Fare beynini salınımlı bir mikrotom kullanarak 500 μm kalınlığında bölümlere ayırın (bkz.
- Floresan bölgeleri bir stereomikroskop kullanarak bir neşter ile küçük bloklar halinde kesin (bkz.
NOT: Küçük blokların hacmi 1 mm'den büyük olmamalıdır3.
- Kültürlenmiş hücreler
- HeLa hücrelerini 6 cm'lik hücre kültürü kaplarına tohumlayın ve bunları büyüme ortamında tutun (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı [DMEM] düşük glikozu,% 10 fetal sığır serumu [FBS] ile desteklenmiştir).
- Ertesi gün, mScarlet içeren plazmitleri, transfeksiyon kitinin talimat kitabını izleyerek DNA transfeksiyon reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak hücrelere aktarın.
- Transfeksiyondan kırk sekiz saat sonra, transfekte edilmiş hücreleri tripsinize edin ve 1.000 × g'da hücre peletleri elde etmek için santrifüjleyin. Hücre peletlerine numune blokları denir.
2. EM numune hazırlama
- Fiksasyon
- Numune bloklarını sabitleyici bir çözelti kullanarak sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakın) gece boyunca 4 °C'de.
- Fiksatif solüsyonu çıkarın ve fiksatif solüsyonu numune bloklarından 0,1 M PB ile 3 x 10 dakika durulayın.
- Osmiyum tetroksit (OsO4) boyama
- Numune bloklarını OsO4 çözeltisi ile sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakın) 4 °C'de 1 saat.
- OsO4 çözeltisini çıkarın ve OsO4 çözeltisini 3 x 10 dakika ddH2O ile durulayın.ampbloklar.
- Uranil asetat (UA) boyama
- Numune bloklarını %2 UA çözeltisi kullanarak boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın) 4 °C'de 1 saat.
- UA çözeltisini çıkarın ve numune bloklarını ddH2O ile 3 x 10 dakika durulayın.
- Gradyan dehidrasyonu
- Numune bloklarını gradyan etanol ile şu şekilde kurutun: 10 dakika boyunca %50, 10 dakika boyunca %70, 10 dakika boyunca %80, 10 dakika boyunca %90 ve %100 etanol içinde 2 x 10 dakika.
- Numune bloklarını susuz asetonla 3 x 10 dakika kurutun.
- Reçine infiltrasyonu
- Numune bloklarına gradyan reçine ile sızın (Malzeme Tablosuna bakın): asetondan reçineye 3 saat boyunca 1:1, asetondan reçineye 1:1 2 saat, asetondan reçineye 1:3 3 saat.
- Saf reçine ile 3 x 12 saat değiştirin.
- Reçine gömme
- Numune bloklarını bir kürdan kullanarak kapsüllere aktarın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Numune bloğunu içeren kapsüle saf reçine ekleyin ve reçineyi fırında 60 °C'de 14-16 saat polimerize edin.
3. Kapak camının altın nanopartiküllerle kaplanması
- Kapak camı temizliği
- Koruyucu gözlükleri temizleme tamponu ile (Malzeme Tablosuna bakın) 142 °C'de 2 saat yıkayın.
- Temizleme tamponunu ddH2O ile 3 x 10 dakika durulayın.
- Kapak bardaklarını dikkatlice susuz etil alkol içeren bir behere aktarın ve gece boyunca inkübe edin.
- Kapakları temiz bir tezgahta birkaç dakika havayla kurutun.
- Kapak gözlüklerini altın nanopartiküllerle kaplayın.
- Cam çimento kullanarak bir masaüstü santrifüjün dönüşünün ortasına bir cam sürgü sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
- Yapışkan notlar kullanarak cam sürgünün ortasına bir kapak camı monte edin.
- Kapak camına 75 μL% 1 pioloform ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
NOT: Formvar'ı da test ettik (Malzeme Tablosuna bakın) ve iyi çalışıyor. - Kapak camının yüzeyinde ince bir pioloform tabakası oluşturmak için 1.360 × g'da (Şekil 2A) 3 dakika döndürün.
- Kapak camı yüzeyini 250 μL% 0.1 poli-L-lizin ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakın) (Şekil 2B).
- ddH2O ile durulayın ve kapak camını birkaç dakika havayla kurutun.
- 80 nm altın nanopartikülleri (Malzeme Tablosuna bakınız) ddH2O ile% 25 (v / v, OD600 = 0.07) (Malzeme Tablosuna bakınız) ile seyreltin ve 15 dakika boyunca sonikat yapın.
- Kapak camı yüzeyini seyreltilmiş altın nanopartikülleri ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin (Şekil 2C).
- ddH2O ile durulayın ve kapak camını birkaç dakika havayla kurutun.
NOT: Pioloform ve altın nanopartiküller ile kaplandıktan 2 hafta sonra iyi çalışır. Ancak kaplandıktan hemen sonra kullanmanızı öneririz.
4. Ultra ince kesit alma
- Numune bloğunun yüzeyini dik açılı bir yamuk şeklinde kesin. Elmas bıçak kullanarak 100 nm kalınlığında kesitler kesin (bkz . Malzeme Tablosu) ve ultramikrotom (bkz. Malzeme Tablosu). Tek bir bölümü kesit bandından ayırın ve tek bölümü su banyosunda yüzdürün.
- Altın nanopartikül kaplı kapak camının ortasına bir damla ddH2O ekleyin. Bir numune döngüsü kullanarak bir kesit alın ve numune döngüsünü su damlasının yüzeyine ters çevirin. Numune halkasını çıkarın, bölümü su damlasının yüzeyinde bırakın.
- Kapak camını birkaç dakika havayla kurutun. Bir keçeli kalem kullanarak kapak camının karşı tarafındaki bölümün etrafına bir halka çizin.
5. Işık mikroskobu görüntüleme
- Floresan geri kazanımı
NOT: İş akışı Şekil 3A'da gösterilmiştir.- Kapak camındaki ultra ince bölüme 10 μL montaj tamponu ( Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. Montaj tamponuna yeni, temiz bir kapak camı yerleştirin.
NOT: Montaj tamponunun temel bileşeni, floresan proteinlerin floresansını geri kazanmak için kullanılan DABCO'dur. Bu, floresan geri kazanımı için çok önemlidir. - Bu iki kapak camını ultra ince bölümle birlikte bir görüntüleme odasına koyun (bkz. Çizilmiş halkalı kapak camının üstte olduğundan emin olun.
- Kapak camındaki ultra ince bölüme 10 μL montaj tamponu ( Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. Montaj tamponuna yeni, temiz bir kapak camı yerleştirin.
- Navigasyon haritasını toplayın.
- Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobunun parlak alan görüntüleme modunda bir işaretleyici olarak çizilen halkayı kullanan kesiti bulun (bkz. Bölümün bir köşesine gitme. Beyaz ışığı açın ve parlak alan görüntüsünü alın.
- Beyaz ışığı kapatın. Lazeri (561 nm) açın ve aynı görüş alanının (FOV) floresan görüntülerini çekin.
- Lazeri kapatın. Bu iki FOV'un %10 örtüştüğünden emin olarak bitişik FOV'a gidin. İkinci FOV'un parlak alan görüntüsünü ve floresan görüntüsünü alın.
- Tüm bölüm kaplanana kadar bu işlemi tekrarlayın. FOV'u dikmek için kullanılabilecek görüntüleme yolunu kaydedin.
NOT: Görüntünün daha yüksek kalitesi için konfokal mikroskobu kullanmanızı öneririz.
- İlgilenilen görüntü hücreleri.
- İlgilendiğiniz hücreleri kolayca hedeflemek için navigasyon haritasını kullanın. Lazeri (561 nm) açın ve ilgilendiğiniz hücrenin 300 kare floresan görüntüsünü alın. Lazeri kapatın.
- Beyaz ışığı açın ve ardışık parlak alan görüntüleri (~100 kare) çekin.
- İlgilendiğiniz başka bir hücreye gidin.
6. EM görüntüleme için hazırlık
NOT: İş akışı Şekil 3B'de gösterilmiştir.
- Ultra ince bölümü yuva ızgarasına aktarın.
- Bir cam kavanozu ddH2O ile doldurun.
- Kapak camlarını hazneden çıkarın ve iki kapak camını cımbızla ayırın. Bölümün bulunduğu kapak camını sıkıştırın, montaj tamponunu yıkayın ve havayla kurutun.
- Tek taraflı bir bıçak kullanarak ultra ince bölümün etrafına bir # puan verin ve #'nin her köşesine 10 μL %12 hidroflorik asit (Malzeme Tablosuna bakın) damlatın. Kapak camını yavaşça suya koyun.
NOT: Hidroflorik asit camla reaksiyona girerek pioloform filmin kapak camından çıkarılmasını kolaylaştırır. Hidroflorik asit toksiktir. Eldivenli kimyasal bir başlıkta kullanın. Cilt ile temas acil tıbbi müdahale gerektirir. - Pioloform filmi ve ultra ince bölümü su yüzeyinde birlikte yüzdürün. Izgaranın ortasındaki bölümü yakalamak için bölüme kaplanmamış bir yuva ızgarası yerleştirin.
- Bir cam slaytı parafilm ile kaplayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ızgarayı pioloform filmle alın. Izgarayı oda sıcaklığında havayla kurutun.
- Bölüm boyama
- Bölümü% 2 UA ve Sato'nun üçlü kurşunu ile boyayın. Daha fazla ayrıntı için, daha önce yayınlanan protokol2'ye bakın.
7. Görüntü analizi
- Navigasyon haritasını birleştirin.
- Ham verilerin konumunu bulun. Navigasyon haritasını dikmek için ImageJ yazılımını açın ( Malzeme Tablosuna bakın).
- Eklentiler'e tıklayın | Dikiş | Izgara/Koleksiyon birleştirme | (Türü) Izgara: sütuna göre yılan | (Sipariş) Yukarı ve Sol (çekim sırasına göre) | Dilim boyutunu ayarlama | Veri yolunu seç | Dosya adını ayarla | Ekran füzyonunu kontrol edin. Farklı FOV'ların birkaç parlak alan görüntüsünden oluşan bir navigasyon haritası olan sonucu gözlemleyin.
- Bir floresan navigasyon haritasını birleştirmek için aynı yöntemi kullanın.
- Parlak alan görüntülerini floresan görüntülerle birleştirin.
- ImageJ yazılımında, Dosya | İthalat | İlgilenilen hücrenin sıralı parlak alan görüntülerini içe aktarmak için Görüntü Sırası.
- Resmin üzerine tıklayın | Yığınlar | Z Projeksiyon | Sıralı parlak alan görüntülerinin toplam yoğunluk projeksiyonu (SIP) görüntüsünü elde etmek için Dilimleri Topla.
- Düzenle | Altın nanoparçacıkların sinyallerinin parlak beyaz noktalar haline gelmesi için parlak alanın SIP görüntüsünü ters çevirmek için ters çevirin.
- ImageJ'de Dosya | İthalat | Sıralı FM görüntülerini içe aktarmak için Görüntü Sırası.
- Resmin üzerine tıklayın | Yığınlar | Z Projeksiyon | Sıralı FM görüntülerinin SIP görüntüsünü elde etmek için Dilimleri Topla.
- Resmin üzerine tıklayın | Renk | SIP parlak alan görüntüsünü SIP FM görüntüsüyle bileşik görüntü olarak birleştirmek için Kanalları Birleştir'i seçin.
- Altın nanopartiküller yeşildir ve floresan proteini kırmızıdır. Resmin üzerine tıklayın | Türü | RGB Rengi , bileşik görüntünün formatını RGB'ye dönüştürmek için kullanılır.
8. EM görüntüleme
- Izgaranın kesit tarafını yukarı doğru tutarak ızgarayı numune tutucusuna yerleştirin.
- Ultra ince kesitin sağ yamuğunun dört farklı köşesine dört bağıl mesafe boyunca bir elektron mikroskobu altında karşılık gelen hücrelerin konumunu kabaca belirlemek için navigasyon haritasını kullanın.
- Altın nanopartikülleri kullanarak hücreleri onaylayın.
- Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile farklı büyütmelerde (4,200x, 6,000x veya 8,200x) EM görüntüleri çekin (Malzeme Tablosuna bakın).
9. FM görüntüsünün EM görüntüsü ile kaydedilmesi
- Kayıt yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın). Arama penceresine easyCLEMv014yazın. easyCLEMv0'ı açmak için easyCLEMv0'a tıklayın. Resim/Sekans üzerine tıklayın | EM görüntüsünü ve bileşik görüntüyü yazılım paneline aktarmak için açın.
- EasyCLEMv0 penceresinde, hizalama modu olarak rijit olmayan (2D veya 3D) seçmek için 2D'ye (x,y,[T]) tıklayın.
- EasyCLEMv0 penceresinde, Kompozit (RGB)color.tif'yi seçmek için dönüştürülecek ve yeniden boyutlandırılacak görüntüyü seçin (muhtemelen FM) seçeneğinin sağındaki açılır kutuya tıklayın. Ardından, EMimage. tif seçmek için Değiştirilmeyecek (muhtemelen EM) görüntü seçin'in sağındaki açılır kutuya tıklayın.
- Kaydı başlatmak için Başlat'a tıklayın.
- EMimage. tif adlı EM görüntü penceresinde, Nokta 1'i altın nanoparçacığın üzerine koymak için bir altın nanoparçacığa tıklayın. Kompozit (RGB)color.tif adlı FM görüntü penceresinde, Nokta 1'i altın nanopartikülün üzerine koymak için karşılık gelen altın nanopartiküle tıklayın.
- LM sinyalini altın nanopartiküllerin EM sinyaliyle onaylamak için Dönüşümü Güncelle'ye tıklayın.
- Yukarıdaki işlemi EMimage. tif adlı EM görüntü penceresinde tekrarlayın ve LM sinyalini aynı altın nanoparçacığın EM sinyaliyle tek tek eşleştirin.
- Kaydı tamamlamak için Durdur'a tıklayın.
- Görüntü hizalamasından sonra, Üst üste bindirilmiş görüntü'ye tıklayın ve Görüntü/Sekans | Dört kanallı görüntüler (kırmızı, yeşil, mavi, gri) içeren bir görüntü yığınını dışa aktarmak için Farklı kaydet.
- ImageJ'yi açın ve Dosya | Bindirmeli görüntüyü içe aktarmak için açın. Resmin üzerine tıklayın | Yığınlar | Katmanlara Yığ Görüntüsü dört kanallı görüntülere ayırmak için.
- Resmin üzerine tıklayın | Renk | Üç kanaldaki (kırmızı, yeşil ve gri) görüntüleri bileşik bir görüntüde birleştirmek için Kanalları Birleştir.
- Resmin üzerine tıklayın | Türü | RGB Rengi, bileşik görüntüyü bir CLEM görüntüsüne dönüştürmek için kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önceki raporlar, mScarlet'in lizozom15'i hedefleyebileceğini gösterdi. Bu protokolde AAV eksprese eden mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) stereotaksik aletler kullanılarak Vglut2-ires-cre fare beyninin M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) içine enjekte edildi. Yukarıda açıklanan protokolü takiben, nihai ilişkili görüntü Şekil 4A'da gösterilmektedir. FM görüntüsü, referans belirteçleri olarak altın nanopartiküller (yeşil noktalar) kullanılarak EM görüntüsüyle doğru bir şekilde hizalanabilir. EM görüntüsünde gösterildiği gibi (Şekil 4C, F), mScarlet lizozomu hedef aldı ve lizozomların içindeki içerikler heterojendir, bunlar ikincil lizozomun tipik özellikleridir.
Şekil 1: Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobuna şematik genel bakış. (A) Fare beyni hazırlığı. Adeno ile ilişkili virüsler fare beynine enjekte edildi. 30 gün sonra, fare beyin dilimlerinin floresan bölgeleri, EM numune hazırlığı için küçük bloklar halinde kesildi. (B) EM numune hazırlama. (C) Elmas bıçak kullanarak ultra ince kesit ve kapak camının şematik diyagramı. (D) FM görüntüleme ve TEM görüntüleme. Kısaltmalar: EM = elektron mikroskobu; FM = floresan mikroskobu; TEM = transmisyon elektron mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kapak camlarının altın nanopartiküllerle kaplanması. (A) Kapak camını santrifüjleme ile pioloform ile örtün. (B) Kapak camı yüzeyini poli-L-lizin ile inkübe edin. (C) Kapak camı yüzeyini seyreltilmiş altın nanopartikülleri ile inkübe edin. (D) Kaplanmış kapak camının şematik diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: FM görüntüleme ve EM görüntüleme için hazırlık programı. (A) FM görüntüleme hazırlıklarının iş akışı beş adımdan oluşur: (i) ultra ince bölümün kepçelenmesi, (ii) Havayla kurutma, (iii) tampon eklendikten sonra ikinci bir kapak camının yerleştirilmesi, (iv) her iki kapak camının hazneye sabitlenmesi ve FM görüntüleme. (B) EM görüntüleme hazırlıklarının iş akışı da beş adımdan oluşur: (i) iki kapak camının ayrılması, (ii) ultra ince bölümün kaydırılması, (iii) ultra ince bölümün alınması, (iv) ultra ince bölümün yuva ızgarasına taşınması ve (v) EM görüntüleme. Kısaltmalar: EM = elektron mikroskobu; FM = floresan mikroskobu; TEM = transmisyon elektron mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: mScarlet'in temsili CLEM görüntüsü. (A) Tüm nöronun CLEM görüntüsü. (B,E) İç kısmın CLEM görüntüleri. (C,F) İç kısmın EM görüntüleri. (D,G) İç kısmın floresan görüntüleri. Yeşil noktalar altın nanopartikülleri gösterir. Ölçek çubuğu = 5 μm (A), 1 μm (ek görüntüler). Kısaltmalar: EM = elektron mikroskobu; FM = floresan mikroskobu; CLEM = bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada sunulan protokol, ışık mikroskobundan (LM) hedef proteinin lokalizasyon bilgisini ve elektron mikroskobundan (EM) hedef proteini çevreleyen bağlamı birleştirebilen çok yönlü bir görüntüleme yöntemidir6. Mevcut floresan proteinlerin sınırlamaları ile yaygın olarak kullanılan yöntem, korelasyon ışığı ve elektron mikroskobunun (CLEM) önceden gömülmesidir, bu da LM görüntülemenin EM numune hazırlığından önce yapıldığı anlamına gelir. Hemen hemen tüm mevcut floresan proteinler CLEM'in önceden gömülmesinde incelenebilir. Bununla birlikte, kaçınılmaz bozulmalar ve büzülmeler nedeniyle, son görüntünün doğru hizalanması imkansızdır6. Bu nedenle, CLEM'in önceden gömülmesiyle sağlanan bilgiler, EM görüntülemede LM tarafından görüntülenen aynı hücrenin ultra yapılarını kontrol etmektir.
Bu çalışma tarafından sağlanan yöntem, EM örnek hazırlandıktan sonra LM görüntülemenin yapıldığı gömme sonrası CLEM'dir. EM numune hazırlamadaki kimyasal fiksasyonun neden olduğu büzülme, nihai görüntünün doğru hizalamasını etkilemez. Ayrıca, hem LM görüntüleme hem de EM görüntüleme aynı bölümde ve altın nanopartiküllerin yardımıyla yapıldığından, nihai görüntü hizalaması çok doğru olabilir. Gömme sonrası CLEM, floresan proteinlerin geleneksel EM numune hazırlığından sonra bir floresan sinyalini tutmasını gerektirir. Daha önce, gömme reçine8 olarak Epon kullanarak floresan sinyallerini tutabilen mEosEM adlı ilk floresan proteini bildirmiştik. Gömme reçineleri olarak diğer reçinelerle karşılaştırıldığında, Epon üstün üst yapı koruma ve kesit alma özelliklerine sahiptir. mEosEM'yi takiben, mKate211,16, mCherry210,17, mWasabi10,18, CoGFPv010,19, mEosEM-E8, mScarlet 8,20, mScarlet-I 8,20, mScarlet-H 8,20 ve HfYFP9 gibi diğer dirençli Epon gömücü floresan proteinler bildirilmiştir.
Deneyimlerimize göre, mScarlet diğer floresan proteinlerden daha üstündür. Fiksatif çözelti, floresan proteinlerin floresansını etkileyebilir. Genel olarak, paraformaldehitin (PFA) fiksasyon ilerleme hızı, glutaraldehitinkinden (GA) çok daha yavaştır; tersine, PFA numuneye daha büyük GA'dan daha hızlı nüfuz eder. PFA ve GA'nın bir karışımı, numunenin kalitesini koruyacak kadar hızlı, ancak oksidasyon gibi numune hasarının meydana gelmeyeceği kadar yavaş sabitlenmesi arasında bir denge sağlar. Daha yüksek GA konsantrasyonu daha yüksek otofloresan üretecektir. Deneyimlerimize göre, reçine bloğundaki mScarlet'in floresansı polimerizasyondan 6 ay sonra tespit edilebilir. Ancak polimerizasyondan hemen sonra CLEM görüntüleme yapılmasını öneriyoruz.
CLEM gömme sonrası bir diğer önemli faktör, LM görüntüsünün EM görüntüsüyle doğru bir şekilde nasıl kaydedileceğidir. Daha önce bildirilen yöntemlere 6,21 dayanarak, protokolde bazı değişiklikler yaptık. Birincisi, EM görüntülemede LM tarafından görüntülenen aynı hücrenin nasıl bulunacağıdır. DIC ve floresan görüntüleme modunu kullanarak tüm ultra ince bölümün navigasyon haritasını dikmek için farklı FOV'lar aldık. Navigasyon haritası kullanılarak, ilgilenilen hücreler kolayca tanımlanabilir. Diğer bir gelişme, doğru görüntü hizalamasıdır. Önceden, floresan görüntüleme modunda floresan sinyalini ve altın nanopartiküllerin EM görüntüleme modunda yüksek elektron kontrast sinyalini referans hizalama belirteçleri6 olarak kullandık. Bununla birlikte, mScarlet kullanıldığında, mScarlet'in floresan sinyali, altın nanopartiküllerin floresan sinyalinden çok daha yüksekti ve altın nanopartiküllerin floresan sinyalini tespit etmek zordu. Bu sorunu çözmek için, floresan sinyali yerine kayıt için altın nanopartiküllerin parlak alan sinyalini kullandık. Bu değiştirilmiş protokolü takiben, gömme sonrası CLEM'i gerçekleştirmek kolaydı.
Ancak, mevcut protokolün kullanılmadan önce dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Aşırı ekspresyon sisteminde iyi çalışmasına rağmen, hedef proteinler doğal promotörleri22'nin altındaysa floresan oldukça zayıftır. Diğer bir sınırlama, mScarlet'in EM numune hazırlığından sonra yeterli floresan sinyallerini tutabilen ve memeli hücrelerinde iyi çalışan en iyi floresan protein (deneyimlerimize göre) olmasına rağmen, mScarlet'i nöronlarda floresan etiketi olarak kullanırken bir sorun olacaktır, bu da hedef proteinlerin yanlış konumuna yol açabilir15. Bu durumlarda, nöronlarda iyi çalışan mScarlet'in bir mutasyonu olan oScarlet15'i kullanmanızı öneririz.
Bu değiştirilmiş protokolün potansiyel uygulamaları iki kategoriye ayrılabilir. Birincisi, hücre altı seviyeye yakınlaştırmaktır, bu da hedef proteini hücre altı bağlamda incelemek anlamına gelir. Daha önce yayınlanan raporlarımızda, bir γ-herpes virüsü23 enfeksiyonu sırasında sitoplazmik virion montaj kompartmanlarının (cVAC'ler) oluşumunu incelemek için gömme sonrası CLEM kullandık. Gelecekteki uygulamalarda, gömme sonrası CLEM, hedef proteinlerin 3D dağılımını elde etmek ve 3D yapıyı doğal olarak çözmek için elektron tomografisi ile birleştirilebilir24. İkinci tür potansiyel uygulama, nöral devreleri çizmek ve analiz etmek için kullanılabilen hücresel seviyeye uzaklaşmaktır. Yüksek çözünürlük kabiliyeti nedeniyle EM, ince beyin bağlantılarını haritalamanın etkili bir yolu haline geldi. Bununla birlikte, EM, nöronların kimliklerini doğru bir şekilde sağlayamaz, bu da nöronal devrenin derinlemesine analizini sınırlar. Epon post-embedding CLEM, üst yapılardan ödün vermeden nöronların kimliklerini nöronal devreye getirme potansiyeline sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu proje, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Zhifei Fu'ya 32201235), Çin'in Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2022J01287'den Zhifei Fu'ya), Fujian Tıp Üniversitesi'ndeki İleri Yetenekler Araştırma Vakfı, Çin (XRCZX2021013'den Zhifei Fu'ya), Çin'in Fujian Eyaleti Finans Özel Bilim Vakfı (22SCZZX002'den Zhifei Fu'ya), NHC İnsan Olmayan Primat için Doğurganlık Düzenlemesinin Teknik Değerlendirmesi Anahtar Laboratuvarı ve Fujian Doğum ve Çocuk Sağlığı Hastanesi'nin kurulması (2022-NHP-04'ten Zhifei Fu'ya). Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknoloji Hizmet Merkezi'nden Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin ve Yan Hu'ya EM numune hazırlama ve EM görüntüleme konusundaki destekleri için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
