Summary
We presenteren een gedetailleerd protocol voor Epon post-embedding correlatieve licht- en elektronenmicroscopie met behulp van een fluorescerend eiwit genaamd mScarlet. Deze methode kan de fluorescentie en de ultrastructuur tegelijkertijd behouden. Deze techniek is geschikt voor een breed scala aan biologische toepassingen.
Abstract
Correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) is een uitgebreide microscopie die de lokalisatie-informatie combineert die wordt geleverd door fluorescentiemicroscopie (FM) en de context van cellulaire ultrastructuur verkregen door elektronenmicroscopie (EM). CLEM is een afweging tussen fluorescentie en ultrastructuur, en meestal brengt ultrastructuur de fluorescentie in gevaar. Vergeleken met andere hydrofiele inbeddingsharsen, zoals glycidylmethacrylaat, HM20 of K4M, is Epon superieur in ultrastructuurbehoud en sectie-eigenschappen. Eerder hadden we aangetoond dat mEosEM osmiumtetroxidefixatie en Epon-inbedding kan overleven. Met behulp van mEosEM hebben we voor het eerst bereikt dat Epon post embedding CLEM gebruikt, dat tegelijkertijd de fluorescentie en de ultrastructuur in stand houdt. Hier geven we stapsgewijze details over de voorbereiding van het EM-monster, de FM-beeldvorming, de EM-beeldvorming en de beelduitlijning. We verbeteren ook de procedures voor het identificeren van dezelfde cel die door FM-beeldvorming wordt afgebeeld tijdens de EM-beeldvorming en detailleren de registratie tussen de FM- en EM-beelden. Wij geloven dat men gemakkelijk kan bereiken met Epon na het inbedden van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie volgens dit nieuwe protocol in traditionele EM-faciliteiten.
Introduction
Fluorescentiemicroscopie (FM) kan worden gebruikt om de lokalisatie en distributie van het doeleiwit te verkrijgen. De context rond het doeleiwit gaat echter verloren, wat cruciaal is om het doeleiwit grondig te onderzoeken. Elektronenmicroscopie (EM) heeft de hoogste beeldresolutie en biedt verschillende subcellulaire details. Desalniettemin ontbreekt het EM aan doeletikettering. Door het fluorescentiebeeld dat door FM is gemaakt nauwkeurig samen te voegen met het grijze beeld dat door EM is verkregen, kunnen correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM) de informatie combineren die wordt verkregen door deze twee beeldvormingsmodi 1,2,3,4.
CLEM is een afweging tussen fluorescentie en de ultrastructuur1. Vanwege de beperkingen van de huidige fluorescerende eiwitten en de traditionele EM-monstervoorbereidingsprocedures, met name het gebruik van osmisch zuur (OsO4) en hydrofobe harsen zoals Epon, brengt de ultrastructuur altijd fluorescentie5 in gevaar. OsO4 is een onmisbaar reagens bij de voorbereiding van EM-monsters, dat wordt gebruikt om het contrast van EM-beelden te verbeteren. Vergeleken met andere inbeddingsharsen is Epon superieur in ultrastructuurconservering en sectie-eigenschappen5. Er zijn echter geen fluorescerende eiwitten die het fluorescentiesignaal kunnen vasthouden na de behandeling van OsO4 en Epon inbedding6. Om de beperkingen van fluorescerende eiwitten te overwinnen, werd pre-embedding CLEM ontwikkeld, waarbij FM-beeldvorming wordt gedaan vóór de voorbereiding van EM-monsters6. Het nadeel van het vooraf inbedden van CLEM is echter de onnauwkeurige registratie tussen de FM- en de EM-beelden5.
Integendeel, de CLEM-methode na inbedding voert de FM-beeldvorming uit na de voorbereiding van het EM-monster, waarvan de registratienauwkeurigheid 6-7 nm 5,6 kan bereiken. Om de fluorescentie van fluorescerende eiwitten te behouden, zijn zeer lage concentraties OsO4 (0,001%)3 of de hogedruk bevroren (HPF) en vriessubstitutie (FS) EM-bereidingsmethoden 4,7 gebruikt ten koste van de aangetaste ultrastructuur of het contrast van het EM-beeld. De ontwikkeling van mEos4b bevordert de voortgang van CLEM na inbedding aanzienlijk, hoewel glycidylmethacrylaat wordt gebruikt als inbeddingshars5. Met de ontwikkeling van mEosEM, dat de OsO4-kleuring en Epon-inbedding kan overleven, werd voor het eerst Epon post-inbedding met superresolutie CLEM bereikt, waarbij de fluorescentie en ultrastructuur tegelijkertijd behoudenbleven 6. Na mEosEM zijn verschillende fluorescerende eiwitten ontwikkeld die de OsO4-kleuring en de Epon-inbedding kunnen overleven 8,9,10,11. Dit bevordert de ontwikkeling van CLEM enorm.
Er zijn drie belangrijke aspecten aan Epon na de inbedding van CLEM. De eerste is het fluorescerende eiwit, dat het fluorescerende signaal moet behouden na de voorbereiding van het EM-monster. Volgens onze ervaring is mScarlet superieur aan andere gerapporteerde fluorescerende eiwitten. De tweede is hoe je dezelfde cel kunt vinden die is afgebeeld door FM-beeldvorming in EM-beeldvorming. Om dit probleem op te lossen, verbeteren we de procedure voor deze stap, zodat men gemakkelijk de beoogde cel kan vinden. De laatste is de methode om het FM-beeld uit te lijnen met het EM-beeld. Hier beschrijven we de registratie tussen de FM- en de EM-beelden. In dit protocol brengen we mScarlet tot expressie in VGLUT2-neuronen en tonen we aan dat mScarlet zich kan richten op secundaire lysosomen met behulp van Epon post-embedding CLEM. We bieden stap-voor-stap details voor Epon post-embedding CLEM, zonder afbreuk te doen aan de fluorescentie en de ultrastructuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Veehouderij en experimenten werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Fujian Medical University Medical Center. De stap-voor-stap workflow van het huidige protocol is weergegeven in figuur 1.
1. Voorbereiding van het monster
- Het brein van de muis
- Koop transgene muizen (zie Materiaaltabel) en oligonucleotideprimers (zie Materiaaltabel) om deze muizen te genotyperen.
- Perfuseren en verwijderen van de intacte hersenen uit het schedelgewelf volgens eerder gepubliceerd protocol12,13.
- Fixeer de muizenhersenen met 10 ml fixeeroplossing (zie Materiaaltabel) bij 4 °C gedurende een nacht.
- Spoel de fixeeroplossing gedurende 3 x 10 minuten af met 0,1 M fosfaatbuffer (PB).
- Snijd de hersenen van de muis in secties met een dikte van 500 μm met behulp van een oscillerende microtoom (zie Tabel met materialen).
- Snijd de fluorescerende gebieden met een scalpel in kleine blokjes met behulp van een stereomicroscoop (zie Tabel met materialen).
OPMERKING: Het volume van de kleine blokjes mag niet groter zijn dan 1 mm3.
- Gekweekte cellen
- Zaai HeLa-cellen in celkweekschaaltjes van 6 cm en bewaar ze in groeimedium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium [DMEM] lage glucose, aangevuld met 10% foetaal runderserum [FBS]).
- Transfecteer de volgende dag de plasmiden die mScarlet bevatten in cellen met behulp van DNA-transfectiereagens (zie Materiaaltabel) volgens het instructieboek van de transfectiekit.
- Achtenveertig uur na transfectie trypsiniseer je de getransfecteerde cellen en centrifugeer je ze om celpellets te verkrijgen bij 1.000 × g. De celpellets worden monsterblokken genoemd.
2. EM-monstervoorbereiding
- Fixatie
- Fixeer de monsterblokken met een fixeeroplossing (zie materiaaltabel) gedurende een nacht bij 4 °C.
- Verwijder de fixeeroplossing en spoel de fixeeroplossing gedurende 3 x 10 min met 0,1 M PB van de monsterblokken.
- Kleuring van osmiumtetroxide (OsO4)
- Fixeer de monsterblokken met OsO4-oplossing (zie materiaaltabel) bij 4 °C gedurende 1 uur.
- Verwijder de OsO4-oplossing en spoel de OsO4-oplossing 3 x 10 min met ddH2O van de monsterblokken.
- Uranylacetaat (UA) kleuring
- Kleur de monsterblokken met 2% UA-oplossing (zie materiaaltabel) bij 4 °C gedurende 1 uur.
- Verwijder de UA-oplossing en spoel de monsterblokken gedurende 3 x 10 min met ddH2O.
- Gradiënt uitdroging
- Dehydrateer de monsterblokken als volgt met gradiënt ethanol: 50% gedurende 10 min, 70% gedurende 10 min, 80% gedurende 10 min, 90% gedurende 10 min en 2 x 10 min in 100% ethanol.
- Dehydrateer de monsterblokken met watervrije aceton gedurende 3 x 10 min.
- Hars infiltratie
- Infiltreer de monsterblokken met gradiënthars (zie Materiaaltabel): aceton naar hars 3:1 gedurende 1 uur, aceton naar hars 1:1 gedurende 2 uur, aceton naar hars 1:3 gedurende 3 uur.
- Vervang door de pure hars gedurende 3 x 12 uur.
- Inbedding van hars
- Breng monsterblokken over in capsules (zie Materiaaltabel) met behulp van een tandenstoker.
- Voeg pure hars toe aan de capsule met het monsterblok en polymeriseer de hars in de oven bij 60 °C gedurende 14-16 uur.
3. Coating van het dekglas met gouden nanodeeltjes
- Dekglas reinigen
- Was de dekglazen met reinigingsbuffer (zie Materiaaltabel) gedurende 2 uur op 142 °C.
- Spoel de reinigingsbuffer 3 x 10 min af met ddH2O.
- Doe de dekglaasjes voorzichtig in een bekerglas met watervrije ethylalcohol en laat ze een nacht incuberen.
- Laat de dekglaasjes enkele minuten aan de lucht drogen op een schone bank.
- Smeer de dekglaasjes in met gouden nanodeeltjes.
- Bevestig een glasplaatje in het midden van de rotatie van een desktopcentrifuge (zie Materiaaltabel) met behulp van glascement.
- Monteer een dekglas in het midden van de glasplaat met behulp van plakbriefjes.
- Voeg 75 μL 1% pioloform (zie Materiaaltabel) toe aan het dekglas.
OPMERKING: We hebben ook Formvar getest (zie Materiaaltabel) en het werkt goed. - Draai gedurende 3 minuten op 1.360 × g (figuur 2A) om een dunne laag pioloform op het oppervlak van het dekglas te verkrijgen.
- Incubeer het oppervlak van het dekglas met 250 μl 0,1% poly-L-lysine (zie materiaaltabel) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (figuur 2B).
- Spoel af met ddH2O en laat het dekglas enkele minuten aan de lucht drogen.
- Verdun 80 nm gouden nanodeeltjes (zie Materiaaltabel) met ddH2O tot 25% (v/v, OD600 = 0,07) (zie Materiaaltabel) en sonificeer gedurende 15 min.
- Incubeer het oppervlak van het dekglas met de verdunde gouden nanodeeltjes gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (figuur 2C).
- Spoel af met ddH2O en laat het dekglas enkele minuten aan de lucht drogen.
OPMERKING: Het werkt goed 2 weken nadat het is gecoat met pioloforme en gouden nanodeeltjes. Maar we raden aan om het onmiddellijk na het coaten te gebruiken.
4. Ultradunne secties
- Snijd het oppervlak van het monsterblok in een rechthoekig trapezium. Snijd secties met een dikte van 100 nm met behulp van een diamantmes (zie Tabel met materialen) met een ultramicrotoom (zie Tabel met materialen). Scheid een enkele sectie van de sectieband en laat de enkele sectie in het waterbad drijven.
- Voeg een druppel ddH2O toe aan het midden van het met goud beklede afdekglas met nanodeeltjes. Pak een sectie op met behulp van een monsterlus en keer de monsterlus om op het oppervlak van de waterdruppel. Verwijder de monsterlus en laat het gedeelte op het oppervlak van de waterdruppel liggen.
- Laat het dekglas enkele minuten aan de lucht drogen. Teken met een markeerstift een annulus rond het gedeelte aan de andere kant van het dekglas.
5. Lichtmicroscopie beeldvorming
- Fluorescentie herstel
OPMERKING: De workflow wordt weergegeven in afbeelding 3A.- Voeg 10 μL montagebuffer (zie Materiaaltabel) toe aan het ultradunne gedeelte op het dekglas. Plaats een nieuw schoon dekglas op de montagebuffer.
OPMERKING: Het belangrijkste onderdeel van de montagebuffer is DABCO, dat wordt gebruikt om de fluorescentie van fluorescerende eiwitten terug te winnen. Dit is erg belangrijk voor het herstel van fluorescentie. - Plaats deze twee dekglaasjes samen met het ultradunne gedeelte in een beeldvormingskamer (zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat het dekglas met de getrokken annulus aan de bovenkant zit.
- Voeg 10 μL montagebuffer (zie Materiaaltabel) toe aan het ultradunne gedeelte op het dekglas. Plaats een nieuw schoon dekglas op de montagebuffer.
- Verzamel de navigatiekaart.
- Zoek de doorsnede met de getekende annulus als marker in de helderveldbeeldvormingsmodus van een omgekeerde fluorescentiemicroscoop (zie Tabel met materialen). Ga naar een hoek van de sectie. Schakel het witte licht in en maak de helderveldopname.
- Doe het witte licht uit. Schakel de laser in (561 nm) en maak fluorescerende beelden van hetzelfde gezichtsveld (FOV).
- Schakel de laser uit. Ga naar het aangrenzende gezichtsveld en zorg ervoor dat deze twee gezichtsvelden elkaar voor 10% overlappen. Neem het helderveldbeeld en het fluorescerende beeld van de tweede FOV.
- Herhaal deze handeling totdat het hele gedeelte bedekt is. Neem het beeldvormingspad op dat kan worden gebruikt om het gezichtsveld te naaien.
OPMERKING: Voor een hogere kwaliteit van het beeld raden we aan om de confocale microscoop te gebruiken.
- Afbeeldingscellen van belang.
- Gebruik de navigatiekaart om eenvoudig interessante cellen te targeten. Zet de laser (561 nm) aan en maak 300 frames met fluorescerende beelden van de cel in kwestie. Schakel de laser uit.
- Schakel het witte licht in en maak sequentiële helderveldfoto's (~100 frames).
- Naar een andere cel gaan.
6. Voorbereiding op EM-beeldvorming
OPMERKING: De workflow wordt weergegeven in afbeelding 3B.
- Breng het ultradunne gedeelte over naar het sleufrooster.
- Vul een glazen pot met ddH2O.
- Haal de dekglaasjes uit de kamer en scheid de twee dekglaasjes met een pincet. Klem het afdekglas waarop de sectie zich bevindt, was de montagebuffer af en laat aan de lucht drogen.
- Snijd een # rond het ultradunne gedeelte met behulp van een enkelzijdig mes en druppel 10 μL 12% fluorwaterstofzuur (zie Materiaaltabel) op elke hoek van de #. Leg het dekglas langzaam in het water.
OPMERKING: Fluorwaterstofzuur reageert met glas, waardoor het gemakkelijker wordt om de pioloforme film van het dekglas te verwijderen. Fluorwaterstofzuur is giftig. Gebruik het in een chemische kap met handschoenen. Contact met de huid vereist onmiddellijke medische aandacht. - Drijf de pioloform-film en het ultradunne gedeelte samen op het wateroppervlak. Plaats een ongecoat sleufraster op de sectie om de sectie in het midden van het raster vast te leggen.
- Bedek een glasplaatje met parafilm (zie Tabel met materialen) en pak het rooster op met de pioloforme film. Laat het rooster aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
- Kleuring van secties
- Vlek de sectie met 2% UA en Sato's drievoudige voorsprong. Voor meer details, zie het eerder gepubliceerde protocol2.
7. Beeldanalyse
- Naai de navigatiekaart samen.
- Zoek de locatie van de onbewerkte gegevens. Open de software ImageJ (zie Tabel met materialen) om de navigatiekaart samen te voegen.
- Klik op Plug-ins | Stiksels | Raster/Collectie stiksels | (Soort) Raster: slang per kolom | (Volgorde) Boven en links (afhankelijk van de opnamevolgorde) | Plakgrootte instellen | Gegevenspad selecteren | Bestandsnaam instellen | Vink Beeldschermfusie aan. Bekijk het resultaat, een navigatiekaart die bestaat uit verschillende helderveldafbeeldingen van verschillende FOV's.
- Gebruik dezelfde methode om een fluorescentienavigatiekaart samen te voegen.
- Voeg de helderveldbeelden samen met de fluorescentiebeelden.
- Klik in de software ImageJ op Bestand | Importeren | Afbeeldingsreeks om de sequentiële helderveldafbeeldingen van de betreffende cel te importeren.
- Klik op Afbeelding | Stapels | Z-projectie | Som segmenten om het SIP-beeld (Sum Intensity Projection S) van de opeenvolgende helderveldbeelden te krijgen.
- Klik op Bewerken | Omkeren om het SIP-beeld van het heldere veld om te keren, zodat de signalen van de gouden nanodeeltjes heldere witte stippen worden.
- Klik in ImageJ op Bestand | Importeren | Image Sequence om de sequentiële FM-beelden te importeren.
- Klik op Afbeelding | Stapels | Z-projectie | Som segmenten om het SIP-beeld van de sequentiële FM-beelden te krijgen.
- Klik op Afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen om het SIP-helderveldbeeld samen te voegen met het SIP FM-beeld als een samengesteld beeld.
- De gouden nanodeeltjes zijn groen en het fluorescerende eiwit is rood. Klik op Afbeelding | Soort | RGB-kleur om het formaat van de samengestelde afbeelding om te zetten in RGB.
8. EM-beeldvorming
- Plaats het rooster op de monsterhouder en houd de sectiezijde van het rooster naar boven.
- Gebruik de navigatiekaart om ruwweg de positie van corresponderende cellen onder een elektronenmicroscoop te identificeren via vier relatieve afstanden tot de vier verschillende hoeken van het rechter trapezium van het ultradunne gedeelte.
- Bevestig de cellen met behulp van de gouden nanodeeltjes.
- Maak EM-beelden met verschillende vergrotingen (4.200x, 6.000x of 8.200x) met een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) (zie Tabel met materialen).
9. Registratie van het FM-beeld met het EM-beeld
- Open de registratiesoftware (zie Materiaaltabel). Typ easyCLEMv014in het zoekvenster. Klik op easyCLEMv0 om easyCLEMv0 te openen. Klik op Afbeelding/Reeks | Open om de EM-afbeelding en de samengestelde afbeelding in het paneel van de software te importeren.
- Klik in het EasyCLEMv0-venster op 2D (x,y,[T]) om niet-rigide (2D of 3D) als uitlijningsmodus te kiezen.
- Klik in het EasyCLEMv0-venster op de vervolgkeuzelijst rechts van Selecteer afbeelding die wordt getransformeerd en vergroot of verkleind (waarschijnlijk FM) om Composiet (RGB)color.tif te kiezen. Klik vervolgens op de vervolgkeuzelijst rechts van Selecteer afbeelding die niet zal worden gewijzigd (waarschijnlijk EM) om EMimage. tif te kiezen.
- Klik op Start om de registratie te starten.
- Klik in het EM-afbeeldingsvenster met de naam EMimage. tif op een goudnanodeeltje om punt 1 op het goudnanodeeltje te plaatsen. Klik in het FM-beeldvenster met de naam Composiet (RGB)kleur.tif op het corresponderende gouden nanodeeltje om punt 1 op het gouden nanodeeltje te plaatsen.
- Klik op Update Transformation om het LM-signaal te bevestigen met het EM-signaal van de gouden nanodeeltjes.
- Herhaal de bovenstaande handeling in het EM-beeldvenster met de naam EMimage. tif en vergelijk het LM-signaal één voor één met het EM-signaal van hetzelfde gouden nanodeeltje.
- Klik op Stop om de registratie af te ronden.
- Klik na het uitlijnen van de afbeelding op Overlayed image en klik op Image/Sequence | Opslaan als om een afbeeldingsstapel met vier kanaalafbeeldingen (rood, groen, blauw, grijs) te exporteren.
- Open ImageJ en klik op Bestand | Open om de overlappende afbeelding te importeren. Klik op Afbeelding | Stapels | Stapel op afbeeldingen om de overlappende afbeelding te scheiden in afbeeldingen met vier kanalen.
- Klik op Afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen om afbeeldingen van drie kanalen (rood, groen en grijs) samen te voegen tot een samengestelde afbeelding.
- Klik op Afbeelding | Soort | RGB-kleur om de samengestelde afbeelding om te zetten in een CLEM-afbeelding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Eerdere rapporten toonden aan dat mScarlet zich kan richten op het lysosoom15. In dit protocol werd AAV-expressie mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) geïnjecteerd in de M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) van Vglut2-ires-cre muizenhersenen met behulp van stereotaxische instrumenten. Volgens het hierboven beschreven protocol wordt het uiteindelijke gecorreleerde beeld weergegeven in figuur 4A. Het FM-beeld kan nauwkeurig worden uitgelijnd met het EM-beeld met behulp van gouden nanodeeltjes (de groene stippen) als fiduciale markers. Zoals te zien is in de EM-afbeelding (figuur 4C,F), richtte mScarlet zich op het lysosoom en de inhoud in lysosomen is heterogeen, wat de typische kenmerken zijn van het secundaire lysosoom.
Figuur 1: Schematisch overzicht van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie. (A) Voorbereiding van de hersenen van muizen. Adeno-geassocieerde virussen werden geïnjecteerd in de hersenen van muizen. Na 30 dagen werden de fluorescerende gebieden van de hersenplakjes van muizen in kleine blokjes gesneden voor de voorbereiding van EM-monsters. (B) Voorbereiding van EM-monsters. (C) Ultradunne doorsnede met behulp van een diamantmes en het schematische diagram van het dekglas. (D) FM-beeldvorming en TEM-beeldvorming. Afkortingen: EM = elektronenmicroscopie; FM = fluorescentiemicroscopie; TEM = transmissie-elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Bedekken van dekglaasjes met gouden nanodeeltjes. (A) Bedek het dekglas met pioloform door middel van centrifugeren. (B) Incubeer het oppervlak van het dekglas met poly-L-lysine. (C) Incubeer het oppervlak van het dekglas met de verdunde gouden nanodeeltjes. (D) Schematisch diagram van het gecoate dekglas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Het schema van voorbereidingen voor FM-beeldvorming en EM-beeldvorming. (A) De workflow van de voorbereidingen voor FM-beeldvorming bestaat uit vijf stappen: (i) het scheppen van het ultradunne gedeelte, (ii) drogen aan de lucht, (iii) het plaatsen van een tweede dekglas na het toevoegen van de buffer, (iv) het bevestigen van beide dekglaasjes in de kamer en FM-beeldvorming. (B) De workflow van de voorbereidingen voor EM-beeldvorming bestaat ook uit vijf stappen: (i) het scheiden van de twee dekglazen, (ii) het zweven van het ultradunne gedeelte, (iii) het opscheppen van het ultradunne gedeelte, (iv) het verplaatsen van het ultradunne gedeelte op het sleufrooster, en (v) EM-beeldvorming. Afkortingen: EM = elektronenmicroscopie; FM = fluorescentiemicroscopie; TEM = transmissie-elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatief CLEM-beeld van mScarlet. (A) Het CLEM-beeld van het hele neuron. (B,E) De CLEM-beelden van de inzet. (C,F) De EM-beelden van de inzet. (D,G) De fluorescentiebeelden van de inzet. Groene stippen duiden op gouden nanodeeltjes. Schaalbalk = 5 μm (A), 1 μm (inzetbeelden). Afkortingen: EM = elektronenmicroscopie; FM = fluorescentiemicroscopie; CLEM = correlatieve licht- en elektronenmicroscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier gepresenteerde protocol is een veelzijdige beeldvormingsmethode, die de lokalisatie-informatie van het doeleiwit uit lichtmicroscopie (LM) en de context rond het doeleiwit uit elektronenmicroscopie (EM)6 kan combineren. Met de beperkingen van de huidige fluorescerende eiwitten is de veelgebruikte methode pre-inbedding van correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM), wat betekent dat de LM-beeldvorming wordt gedaan vóór de voorbereiding van het EM-monster. Bijna alle bestaande fluorescerende eiwitten kunnen worden onderzocht in pre-embedding CLEM. Vanwege de onvermijdelijke vervormingen en krimpen is een nauwkeurige uitlijning van het uiteindelijke beeld echter onmogelijk6. Daarom is de informatie die wordt verstrekt door pre-embedding CLEM bedoeld om de ultrastructuren van dezelfde cel te controleren die door LM in EM-beeldvorming zijn afgebeeld.
De methode die door deze studie wordt geboden, is post-embedding CLEM, waarbij LM-beeldvorming wordt gedaan na de voorbereiding van EM-monsters. De krimp die wordt veroorzaakt door de chemische fixatie in de voorbereiding van het EM-monster heeft geen invloed op de nauwkeurige uitlijning van het uiteindelijke beeld. Bovendien, omdat zowel LM-beeldvorming als EM-beeldvorming op hetzelfde gedeelte en met behulp van gouden nanodeeltjes worden gedaan, kan de uiteindelijke beelduitlijning zeer nauwkeurig zijn. Post-embedding CLEM vereist dat de fluorescerende eiwitten een fluorescerend signaal behouden na conventionele EM-monstervoorbereiding. Eerder hadden we het eerste fluorescerende eiwit gemeld, mEosEM genaamd, dat fluorescerende signalen kan vasthouden met behulp van Epon als inbeddingshars8. Vergeleken met andere harsen als inbeddingsharsen, heeft Epon superieure eigenschappen voor het behoud van ultrastructuren en secties. Na mEosEM werden andere resistente Epon-inbedding fluorescerende eiwitten gerapporteerd, zoals mKate211,16, mCherry210,17, mWasabi 10,18, CoGFPv010,19, mEosEM-E8, mScarlet 8,20, mScarlet-I 8,20, mScarlet-H 8,20 en HfYFP9.
Volgens onze ervaring is mScarlet superieur aan andere fluorescerende eiwitten. Fixerende oplossing kan de fluorescentie van fluorescerende eiwitten beïnvloeden. Over het algemeen is de fixatiesnelheid van paraformaldehyde (PFA) veel langzamer dan die van glutaaraldehyde (GA); omgekeerd dringt PFA sneller door in het monster dan de grotere GA. Een mengsel van PFA en GA zorgt voor een evenwicht tussen het snel genoeg fixeren van het monster zodat de kwaliteit behouden blijft, maar langzaam genoeg zodat er geen monsterschade zoals oxidatie optreedt. De hogere GA-concentratie zal een hogere autofluorescentie veroorzaken. Uit onze ervaring blijkt dat de fluorescentie van mScarlet in harsblok 6 maanden na polymerisatie kan worden gedetecteerd. Maar we raden aan om CLEM-beeldvorming onmiddellijk na polymerisatie uit te voeren.
Een andere belangrijke factor bij het post-embedden van CLEM is hoe het LM-beeld nauwkeurig kan worden geregistreerd bij het EM-beeld. Op basis van eerder gerapporteerde methoden 6,21 hebben we enkele wijzigingen in het protocol aangebracht. De eerste is hoe je dezelfde cel kunt vinden die door LM in beeld is gebracht in EM-beeldvorming. We hebben verschillende FOV's genomen om de navigatiekaart van het hele ultradunne gedeelte te naaien met behulp van DIC en fluorescentiebeeldvormingsmodus. Met behulp van de navigatiekaart konden de cellen van belang gemakkelijk worden geïdentificeerd. Een andere verbetering is de nauwkeurige uitlijning van het beeld. Eerder gebruikten we het fluorescerende signaal in fluorescentiebeeldvormingsmodus en een hoog elektronencontrastsignaal in de EM-beeldvormingsmodus van de gouden nanodeeltjes als de fiduciale uitlijningsmarkers6. Bij het gebruik van mScarlet was het fluorescerende signaal van mScarlet echter veel hoger dan het fluorescerende signaal van de gouden nanodeeltjes en was het moeilijk om het fluorescerende signaal van gouden nanodeeltjes te detecteren. Om dit probleem op te lossen, gebruikten we het helderveldsignaal van de gouden nanodeeltjes voor registratie in plaats van het fluorescerende signaal. Door dit aangepaste protocol te volgen, was het eenvoudig om CLEM na het inbedden uit te voeren.
Er zijn echter enkele beperkingen van het huidige protocol, waarmee rekening moet worden gehouden voordat het wordt gebruikt. Hoewel het goed werkt in het overexpressiesysteem, is de fluorescentie vrij zwak als de doeleiwitten zich onder hun oorspronkelijke promotor22 bevinden. Een andere beperking is dat, hoewel mScarlet het beste fluorescerende eiwit is (volgens onze ervaring) dat voldoende fluorescentiesignalen kan vasthouden na EM-monstervoorbereiding en goed werkt in zoogdiercellen, het een probleem zal zijn bij het gebruik van mScarlet als een fluorescerende tag in neuronen, wat kan leiden tot de verkeerde locatie van de doeleiwitten15. In deze gevallen raden we aan om oScarlet15 te gebruiken, een mutatie van mScarlet, die goed werkt in neuronen.
De mogelijke toepassingen van dit aangepaste protocol kunnen worden onderverdeeld in twee categorieën. De eerste is om in te zoomen op het subcellulaire niveau, wat betekent dat het doeleiwit in de subcellulaire context wordt bestudeerd. In onze eerder gepubliceerde rapporten gebruikten we post-embedding CLEM om de vorming van cytoplasmatische virionassemblagecompartimenten (cVAC's) te onderzoeken tijdens infectie door een γ-herpesvirus23. In toekomstige toepassingen kan post-embedding CLEM worden gecombineerd met elektronentomografie om de 3D-verdeling van de doeleiwitten te verkrijgen en de 3D-structuur native op te lossen24. Het tweede type mogelijke toepassing is om uit te zoomen naar het cellulaire niveau, dat kan worden gebruikt om neurale circuits te tekenen en te analyseren. Door zijn hoge resolutie is EM een effectief middel geworden om fijne hersenverbindingen in kaart te brengen. EM kan echter niet nauwkeurig de identiteit van neuronen geven, wat de diepgaande analyse van het neuronale circuit beperkt. Epon post-embedding CLEM heeft het potentieel om de identiteit van neuronen in het neuronale circuit te brengen zonder de ultrastructuren in gevaar te brengen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (32201235 aan Zhifei Fu), de Natural Science Foundation van de provincie Fujian, China (2022J01287 aan Zhifei Fu), de Research Foundation for Advanced Talents aan de Fujian Medical University, China (XRCZX2021013 aan Zhifei Fu), de Finance Special Science Foundation van de provincie Fujian, China (22SCZZX002 aan Zhifei Fu), Oprichting van NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, en Fujian Maternity and Child Health Hospital (2022-NHP-04 tot Zhifei Fu). We danken Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin en Yan Hu van het Public Technology Service Center, Fujian Medical University voor hun ondersteuning bij de voorbereiding van EM-monsters en EM-beeldvorming.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
