Overview
フルーツハエは複雑な嗅覚システムを持ち、何百もの臭気を区別し、嗅覚を使って行動の決定を指示することができます。このビデオでは、ハエの嗅覚行動応答を研究する方法である4ウェイ嗅覚計アッセイについて説明します。注目のプロトコルクリップは、テストハエを処理する方法と、アッセイを実行しながら重要なステップを示しています。
Protocol
このプロトコルは、Linらからの抜粋であり、4象限のオルファクトメーター 、J.Vis.Exp.(2016)におけるショウジョウバエのコンピュータ追跡によってアッセイされた嗅覚行動。
1. 魅力と忌避臭気への行動応答
- 温度コントローラの電源を入れ、25°Cに設定します。
- 臭気室の出口にチューブを挿入し、行動ボックスにプッシュ接続フィッティングに、臭気チャンバー(制御およびテスト臭気)を接続します。
- 各象限の流量を確認するには、エアフローメーターを使用して、制御および臭気流が 100 ml/min に等しいことを確認します。
- PTFEフライアリーナとガラスプレートを70%エタノール2~3回洗浄し、完全に空気乾燥させます(〜3〜4分)。
- ガラス板をクランプでアリーナに貼り付けます。
- ガラスプレートの1つの穴を通って、CO2 麻酔なしでアリーナに飛び乗る。転送後、ハエが逃げるのを防ぐために、穴に円形のメッシュを置きます。
注:CO2麻酔はショウジョウバエの行動に影響を与えることを示されており、行動実験の24時間以内に使用すべきではありません。 - ライトタイトなチャンバーにハエを持つアリーナを配置し、行動ボックスのプッシュ接続フィッティングに取り付けられたチューブをアリーナコーナーに接続して4つのコントロールエアストリームを接続し、チャンバーのドアを閉め、ハエが新しい環境に順応できるように10〜15分待ちます。可能であれば、実験が行われる部屋のライトをオフにして、実験結果に偏る可能性のある最小限の光漏れを避けます。
- ハエが4つの制御空気の流れにさらされる5-10分制御実験を実行します。
- データをすぐに分析し (下記のデータ分析セクションを参照)、ハエがアリーナで均一に分布し、アトラクション指数が0に近づいていることを確認します。このステップは、アリーナ内に好ましくない場所や回避の源(例えば 、外部からの光漏れ、不均一な温度分布、不均一なアリーナ、臭気汚染など)がないことを確認するために不可欠です 。ハエが不均一に分布しているか、または運動活動が低い場合は、ハエを捨て、再びアリーナを清掃し(ステップ1.4)、新しいハエのバッチを使用して実験を繰り返します。
- 3方向バルブのスイッチを入れるか、コネクタチューブを再び差し込んで、テスト用の臭気チャンバーをセットアップに接続します。
- テスト実験を 5 ~ 10 分間実行し、下のセクション 2 (図 1)で説明したデータを分析します。20 分を超える記録を行うと、データ ファイルが計算処理が困難になる可能性があります。より長い実験記録が必要な場合は、追跡プログラムを迅速に停止し、再開します。これにより、実験録音間の間隔は約10秒になります。
- ハエを捨てる。
- 70%エタノール(ステップ1.4)でアリーナとガラスプレートを清掃し、ライトタイトエンクロージャ内のコネクタチューブを交換してください。実験を迅速化するために、新しいクリーンアリーナを使用し、実験走行中に汚れたアリーナを清掃することができます。
- 必要に応じて、新しいハエのバッチで別の実験を実行します。同じ日に複数の実験を行う場合は、以前のテスト実行からシステムに臭気が残らないように細心の注意を払ってください。これは通常、低濃度の臭気やCO2では問題ありませんが、高濃度の刺激のためには実験走行間の24時間のギャップが必要になる場合があります。また、制御実験中に臭気汚染が疑われる場合は、フローチューブ後のすべてのチューブを交換することができます。実験の間は常に乾いた空気をオンにしたままにして、システムを継続的にフラッシュします。
2. データ分析
注: 提案されたフライ追跡取得ソフトウェア(マテリアルで詳述)は、取得中にリアルタイムで飛行を追跡し、検出されたすべてのハエのタイムスタンプと座標を*.dat形式で保存します。私たちは、データをMatlab形式に変換し、データを分析するために、カスタムメイドのMatlabルーチンを開発しました。コード例は補足資料で提供されていますが、実装の詳細はデータ収集に使用されるソフトウェアによって異なります。
- 生データを読み込みます。アリーナの輪郭に従ってマスクを適用する空間マスクを作成し、生データにマスクを適用して、ノイズを表すアリーナの外にあるすべてのデータ ポイントを削除します (図 2A、補足コードマスクフィルター処理.m、スコア.m、DrawCircularMask.m)。
- このデータは、ノイズまたは非移動ハエによって生成される可能性が高いため、3s より長い速度で 0.163 cm/s 未満の速度で移動するすべてのデータ ポイントを削除します (図 2B、補足コードテンポラル フィルタリング.m)。
- 残りのデータポイントを一度にプロットするか、単一の軌道としてプロットして視覚化します(図1、補足コードSingleTrajectoryViewer.m)。
注:4フィールドにおける臭い境界の位置は、各臭気の特性や使用される気流速度など、多くの要因に依存する可能性があります。例えば、揮発性の高い臭気は、揮発性の低い臭気よりも完全に臭い象限を満たす可能性が高い。これにより、各臭気がわずかに異なる臭気境界を呈する可能性が高い。光イオン化検出器を使用して臭気の境界を測定することは、真空を使用して特定の場所から空気をサンプリングするため、その場所での臭気濃度を乱すため、問題になる可能性があります。しかし、ハエの行動データに基づいて、臭いの境界を迅速に推定することができます。例えば、異なる匂いに反応して累積フライトラックに基づく臭い境界は、図1Cおよび1Dで明確に観察することができる。 - コントロール実験が好みの応答を生成しないかどうかを判断し、また、臭気(または光遺伝学的)刺激に対する応答にアクセスするかどうかを決定するために、アトラクション指数を計算します。アトラクション指数(AI)を計算するには、コントロールまたはテスト記録の最後の5分を使用します。+1 (絶対引力) と -1 (絶対反発) の間にあるアトラクションの測定値を取得するには、次の式を使用して AI を計算します。
N検定はテスト象限のデータポイント数であり、N制御は3つの制御象限のデータポイントの平均数です。このメジャーは、好みがゼロに近い値で示されることがないため、直感的です。ただし、臭気象限に位置するハエの総数の割合を正しく示していません。このメジャーを取得するには、パーセントインデックス (PI) を使用できます。
ここで、N検定はテスト象限のデータポイントの数、Nの合計は 4 つの象限のデータポイントの合計数です。この式は、0 から 1 の間に収まるメジャーを提供し、0.25 は動作の好みに対応していません (図 1Eと2C、補足コードAttractionIndex.m)。 - 各実験条件の5〜10回の繰り返しを実行し、各繰り返しに新しいハエのグループを使用します。コルモゴロフスミルノフ非パラメトリック検定を使用して、条件間またはコントロールとの間のアトラクションインデックスを比較します(Matlabの図1F、kstest2関数)。
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Representative Results
図1:4フィールド嗅覚アッセイを用いて生成したデータ例 (A) 4 フィールドアリーナの概略図。(B)4つの象限すべてに乾燥した空気灌流しか含まれていない場合、中性応答が観察される。(C)左上象限から浸透したリンゴ酢の6.25%希釈に対するアトラクションの反応。(D) 10%エチルプロピオン酸によって引き起こされる反発行動。図2B-2Dでは、取得したデータから単一の軌道がプロットされる。カラーグラデーションは、それぞれ、録音の開始と終了に青と赤の色で、記録の時間経過を示すために使用されます。(E) アトラクション指数(AI)とパーセンテージ指数(PI)の比較。(F) 臭気のない3-6実験の平均AI(コントロール)、アップルサイダービネガー(ACV)、10%エチルプロピオン酸(EP)。誤差範囲は、SEM.SEM.の統計的差がコルモゴロフ・スミルノフ検定によって評価されたことを示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:データ分析ステップで生成されるデータの例 (A) マスク空間フィルタリングによって実行されるデータの空間フィルタリング.mアリーナの外にあるデータ ポイントを削除します。赤い円は、アリーナの境界を定義するために使用される円の初期位置を示します。黒い円は最終的な位置で、円の輪郭をデータに合わせると得られます(4つのフィールド内の灰色の領域)。赤い点と黒の矢印は、このフィルター処理の手順の後にデータセットから削除されるデータ ポイントを示します。(B) データの時間的なフィルタリング、テンポラルフィルタリングによって実行.m。このフィルタリングステップは、動かないハエやアリーナからの汚れ/反射によって生成される可能性が高いため、非常にゆっくりと移動するデータポイントやまったく移動しないデータポイントを削除します。赤い点で囲まれた赤い点は、このフィルタリング手順で削除される同じ座標を持つ約6,000のデータポイントの位置を示します。(C)アトラクション指数(AI)とパーセンテージインデックス(PI)は、アトラクションインデックス.mによる実験の最後の5分にわたって10秒ビンで計算されます。これらのインデックスの時系列プロファイルには、行動応答のダイナミクスに関する情報が含まれ、行動の詳細な分析に使用できます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補足コード ファイル。このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50 Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100 Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1 pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 18-Jan | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture software | The Imagingsource, NC, USA | (http://www.theimagingsource.com/) | |
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
