Overview
과일 파리는 복잡한 후각 시스템을 가지고, 냄새의 수백을 차별 할 수 있습니다, 행동 결정을 지시하기 위해 자신의 냄새의 감각을 사용합니다. 이 비디오는 4방향 올리소미터 분석법, 파리의 후각 행동 반응을 연구하는 방법에 대해 설명합니다. 추천 프로토콜 클립은 분석기를 수행하는 동안 테스트 파리를 처리하는 방법과 중요한 단계를 보여줍니다.
Protocol
이 프로토콜은 Lin 외., 4사분성 올리미터, J. Vis. Exp. (2016)에서 드로소필라의 컴퓨터 추적에 의해 분석된 후각 행동에서 발췌한 것입니다.
1. 매력적이고 구충제 오취제에 대한 행동 적 반응
- 온도 컨트롤러를 켜고 25 °C로 설정합니다.
- 도취챔버(제어 및 테스트 악취)를 도취챔버 의 출구에 삽입하고 동작 상자에 푸시-투-커넥트 피팅에 연결합니다.
- 각 사분면의 유량을 확인하여 공기 흐름 계를 사용하여 제어 및 냄새 있는 공기 스트림이 100ml/min과 동일한지 확인합니다.
- PTFE 플라이 경기장과 유리 판을 70% 에탄올 2-3번 청소하고 완전히 공기 건조(~3-4분)를 허용합니다.
- 유리 판을 클램프로 경기장에 부착합니다.
- CO2 마취없이 유리 판 중 하나의 구멍을 통해 경기장으로 전송합니다. 전송 후, 파리가 탈출하지 않도록 구멍에 원형 메쉬를 배치합니다.
참고: CO2 마취는 Drosophila 행동에 영향을 미치기 위하여 보였고 행동 실험의 24 시간 안에 이용해서는 안 됩니다. - 빛이 꽉 챔버에 파리와 경기장을 배치, 경기장 모서리에 푸시 - 투 - 연결 피팅에 부착 된 튜브를 연결하여 네 개의 제어 공기 스트림을 연결, 챔버의 문을 닫고 파리가 새로운 환경에 적응 할 수 있도록 10-15 분을 기다립니다. 가능하면 실험이 수행되는 방에서 조명을 끄고 실험 결과를 편향시킬 수 있는 최소한의 광 누출을 방지합니다.
- 파리가 4개의 제어 공기 스트림에 노출되는 5-10분 제어 실험을 실행합니다.
- 데이터를 즉시 분석(아래 데이터 분석 섹션 참조)을 분석하여 파리가 경기장에서 균일하게 분포되고 어트랙션 인덱스가 0에 가깝는지 확인합니다. 이 단계는 경기장 내에서 통제되지 않은 선호 또는 회피원이 없음을 확인하므로필수적입니다(예: 외부에서 누출되는 빛, 고르지 않은 온도 분포, 고르지 않은 경기장, 악취 오염 등). 파리가 동등하게 분포되거나 운동 활동이 낮은 경우 파리를 버리고 경기장을 다시 청소 (1.4 단계)하고 새로운 플라이 배치를 사용하여 실험을 반복하십시오.
- 3방향 밸브를 켜거나 커넥터 튜브를 다시 연결하여 테스트 악취 챔버를 설정에 연결합니다.
- 5-10분 동안 테스트 실험을 실행하고 아래 섹션 2에서 설명한 대로 데이터를 분석합니다(그림1). 20분 이상 녹음하면 계산 처리가 어려울 수 있는 데이터 파일이 발생할 수 있습니다. 실험 기록이 길어지면 추적 프로그램을 빠르게 중지하고 다시 시작합니다. 이렇게 하면 실험 기록 간에 ~10초 간격이 발생합니다.
- 파리를 버리십시오.
- 70% 에탄올(1.4단계)으로 깨끗한 경기장 및 유리 판을 청소하고 조명이 꽉 찬 인클로저 내의 커넥터 튜브를 교체합니다. 실험을 촉진하기 위해 새로운 깨끗한 경기장을 사용할 수 있으며 실험적인 실행을 수행하는 동안 더러운 경기장을 청소할 수 있습니다.
- 필요한 경우 새 파리 배치로 다른 실험을 실행합니다. 같은 날에 여러 실험이 실행되는 경우 이전 테스트 실행에서 시스템에 악취가 남지 않도록 주의하십시오. 이것은 일반적으로 악취의 낮은 농도 또는 CO2와문제가 되지 않습니다., 하지만 고농축 자극에 대 한 최대 24 실험 실행 사이 간격이 필요할 수 있습니다. 또한, 제어 실험 중에 악취 오염이 의심되는 경우 유동 관 후의 모든 튜브를 교체할 수 있다. 항상 지속적으로 시스템을 플러시실험 사이에 건조 공기를 둡니다.
2. 데이터 분석
참고: 제안된 플라이 트래킹 획득 소프트웨어(머티리얼즈에 자세히 설명됨)는 획득 하는 동안 실시간으로 파리를 추적하고 감지된 모든 파리의 타임스탬프와 좌표를 *.dat 형식으로 저장합니다. 데이터를 Matlab 형식으로 변환하고 데이터를 분석하기 위해 맞춤형 Matlab 루틴을 개발했습니다. 코드 예제는 보충 자료에 제공되지만 구현 세부 사항은 데이터 수집에 사용되는 소프트웨어에 따라 달라집니다.
- 원시 데이터를 로드합니다. 경기장의 윤곽을 따라 공간 마스크를 만들고 원 데이터에 마스크를 적용하여 노이즈를 나타낼 때 경기장 외부에 있는 모든 데이터 포인트를 제거합니다(그림2A, 보충 코드 마스크공간 필터링.m, 점수.m, DrawCircularMask.m).
- 이 데이터는 노이즈 또는 비 이동 파리에 의해 생성 될 가능성이 있기 때문에, 3s 이상 0.163cm / s 이하의 속도로 이동 하는 모든 데이터 포인트를 제거(그림 2B, 보충 코드 임시 필터링.m).
- 한 번에 또는 단일 궤적으로 모두 플롯하여 나머지 데이터 포인트를 시각화합니다(그림1, 보충 코드 단일 궤도뷰어.m).
참고: 4개 분야에서 악취 경계의 위치는 각 악취의 특성및 사용되는 기류 속도와 같은 여러 가지 요인에 따라 달라집니다. 예를 들어, 휘발성이 높은 냄새는 휘발성 이적은 냄새보다 악취 사분면을 더 온전히 채울 것입니다. 따라서, 각 냄새는 약간 다른 냄새 경계를 나타낼 수 있습니다 가능성이 높습니다. 특정 지점에서 공기를 샘플링하기 위해 진공을 사용하여 악취 경계를 측정하는 광화 검출기를 사용하면 문제가 될 수 있으므로 그 자리에서 악취 농도가 방해됩니다. 그럼에도 불구하고 플라이 행동 데이터를 기반으로 악취 경계를 빠르게 추정할 수 있습니다. 예를 들어, 다양한 냄새에 반응하여 구액 플라이 트랙에 기초한 악취 경계는 도 1C 및 1D에서명확하게 관찰될 수 있다. - 어트랙션 인덱스를 계산하여 제어 실험이 선호도 응답을 생성하지 않는지 여부를 결정하고 또한 냄새(또는 광유전학) 자극에 대한 반응에 액세스합니다. 어트랙션 인덱스(AI)를 계산하려면 컨트롤 또는 테스트 레코딩의 마지막 5분동안 사용하십시오. +1(절대 매력)과 -1(절대 반발) 사이에 속하는 어트랙션의 척도를 얻으려면 다음과 같은 수식이 AI를 계산하는 데 사용됩니다.
N테스트가 테스트 사분면의 데이터 포인트 수인 경우 N컨트롤은 세 컨트롤 사분면의 평균 데이터 포인트 수입니다. 이 측정값은 거의 제로값으로 기본 설정이 표시되지 않는 직관적입니다. 그러나 악취 사분면에 있는 총 파리 수의 비율을 제대로 나타내지는 않습니다. 이 측정값을 얻으려면 백분율 인덱스(PI)를 사용할 수 있습니다.
여기서 N테스트는 테스트 사분면의 데이터 포인트 수이고 N합계는 네 사분면 모두의 총 데이터 포인트 수입니다. 이 수식은 행동 기본 설정 없음에 해당하는 0.25(그림1E 및 2C, 보충 코드 어트랙션인덱스.m)와 함께 0과 1 사이의 측정값을 제공합니다. - 각 실험 조건의 5-10 반복을 실행하여 각 반복에 대해 새 파리 그룹을 사용합니다. 콜모고로프-스미르노프 비파라메트릭 테스트(그림 1 F, Kstest2 함수)를 사용하여 조건 간 또는 컨트롤에 대한 어트랙션 인덱스를 비교합니다(Matlab의 그림 1F,kstest2 기능).
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Representative Results
그림 1: 4필드 후각 분석서를 사용하여 생성된 예제 데이터입니다. (A)4필드 경기장의 회로도. (B)네 사분면이 모두 건조한 공기 관류만 을 포함할 때 중립 반응이 관찰된다. (C)왼쪽 상부 사분면에서 침전된 사과 사이다 식초의 6.25% 희석에 대한 어트랙션 응답. (D)10% 에틸 프로피오네이트에 의해 트리거된 반발 행동. 도 2B-2D에서 획득된 데이터로부터 의 단일 궤적이 플롯됩니다. 색상 그라데이션은 녹음 시간 과정을 의미하는 데 사용되며 파란색과 빨간색 색상은 각각 레코딩의 시작과 끝입니다. (E)어트랙션 지수(AI)와 백분율 지수(PI)의 비교. (F)평균 AI의 3-6 실험은 냄새가 없는 실험(제어), 애플 사이다 식초(ACV) 및 10% 에틸 프로피오네이트(EP). 오류 막대는 콜모고로프-스미르노프 테스트에서 SEM. 통계적 차이를 평가했음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 데이터 분석 단계에 의해 생성된 예제 데이터입니다. (A)마스크공간여과에 의해 수행된 데이터의 공간 필터링.m 경기장 외부에 떨어지는 데이터 포인트를 제거한다. 빨간색 원은 경기장의 테두리를 정의하는 데 사용되는 원의 초기 위치를 표시합니다. 검은 색 원은 원 윤곽선을 데이터에 맞게 획득한 최종 위치입니다(4필드 내부의 회색 음영 영역). 빨간색 점과 검은색 화살표 헤드는 이 필터링 단계 후에 데이터 집합에서 제거될 데이터 점을 나타냅니다. (B)측두엽에 의해 수행된 데이터의 시간적 필터링.m. 이 필터링 단계는 움직이는 비이동 파리 또는 경기장에서 먼지/반사로 생성될 가능성이 있기 때문에 매우 느리게 또는 전혀 이동하지 않는 데이터 점을 제거합니다. 대시된 빨간색 상자로 둘러싸인 빨간색 점은 이 필터링 단계에서 제거할 동일한 좌표가 있는 ~6,000개의 데이터 포인트의 위치를 나타냅니다. (C)어트랙션 인덱스(AI) 및 백분율 지수(PI)는 어트랙션인덱스(attractionIndex)의 실험 마지막 5분 동안 10초 만에 계산됩니다.m. 이러한 인덱스의 시간적 프로파일에는 행동 반응의 역학에 대한 정보가 포함되어 있으며 동작에 대한 자세한 분석에 사용될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
추가 코드 파일입니다. 이 파일을 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드하려면 마우스 오른쪽 클릭).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Air delivery system | (Quantity needed) | ||
| Tubing and connectors | |||
| Thermoplastic NPT(F) Manifolds | Cole-Parmer, IL, USA | R-31522-31 | 1 |
| Hex reducing nipple (1/4MNPT->1/8MNPT) | McMaster-Carr, IL, USA | 5232T314 | 1 |
| Tubing (ID:1/8) | McMaster-Carr, IL, USA | 5108K43 | 50 Ft |
| Tubing (ID:1/16) | McMaster-Carr, IL, USA | 52355K41 | 100 Ft |
| Barbed tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5117K71 | 1 pack |
| Push-to-connect tube fittings | McMaster-Carr, IL, USA | 5779K102 | 4 |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K439 | 1 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/8BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K438 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/8MNPT->1/16BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5463K4 | 2 pack (10) |
| Barbed Tube Fittings (1/4MNPT->1/4BF) | McMaster-Carr, IL, USA | 5670K84 | 1 |
| Hex head plug | McMaster-Carr, IL, USA | 48335K152 | 1 |
| Air pressure regulator, air filter and flowmeters | (Quantity needed) | ||
| Labatory gas drying unit | W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, USA | Model: L68-NP-303; stock #26840 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-30 | 1 |
| Multitube frames for 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R03215-76 | 1 |
| 150 mm flowtubes | Cole-Parmer, IL, USA | R-03217-15 | 9 |
| Valve Cartridge | Cole-Parmer, IL, USA | R-03218-72 | 9 |
| Precision Air regulator | McMaster-Carr, IL, USA | 6162K13 | 1 |
| Soleniod valves | Automate Scientific, Berkeley, CA | 02-10i | 4 |
| Solenoid valve controller | ValveLink 8.2, Automate Scientific, Berkeley, CA | 18-Jan | 1 |
| Electronic flow meter | Honeywell | AWM3100V | 1 |
| DAQ (NI USB-6009, National Instruments) and a | National Instruments | NI USB-6009 | 1 |
| Power supply | Extech Instruments | 382200 | 1 |
| Odor chambers | |||
| Polypropylene Wide Mouth jar 2 oz; 60 ml | Nalgene | 562118-0002 | At least 5 are required per experiment, but a separate chamber is required for each dillution of each odorant. Available at Container Store, part #635114) |
| Glass odor chamber, 0.25 oz | Sunburst Bottle | LB4B | At least 5 are required per experiment |
| "In" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 214224PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| "Out" valve for odor chamber | Smart Products, Inc., CA, USA | 224214PB-0011S000-4074 | 1 of these parts is used per odor chamber but they need to be replaced frequently |
| O ring | RT Dygert International, MN, USA | AS568-029 Buna-N O-R | 1 pack (100) |
| Fly arena, camera and behavior boxes | (Quantity needed) | ||
| Behavior and camera box material | Interstate plastics, CA, USA | ABS black extruded (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php) | 1803 sq inch |
| Teflon for fly arena and odor chamber inserts, 3/8" thick, 12" x 12" | McMaster-Carr, IL, USA | 8545K27 | 1 |
| Glass plates, 1/8" Thick, 9" x 9" | McMaster-Carr, IL, USA | 8476K191 | 2 |
| Dual action thermoelectric controller | WAtronix Inc, CA, USA | DA12V-K-0 | 1 |
| IR LED array | Advanced Illumination, Rochester, VT, USA | AL4554-88024, PS24-TL | 2 LED arrays and one power supply |
| Air conditioner Unit | Melcor Store | MAA280T-12 | 1 |
| Imaging system | (Quantity needed) | ||
| Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 mm F/1.4) C-mount Lens | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | PEC21211 KP | 1 |
| CCXC-12P05N Interconnect Cable | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SOCCXC12P05N | 1 |
| DC-700 Camera Adapter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | SODC700 | 1 |
| B+W 40,5 093 IR filter | B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, NY, USA | 65-072442 | 1 |
| TiFFEN 40.5 mm Circular polarizer | Amazon | 1 | |
| IR Videocamera | Industrial Vision Source, FL, USA | Sony XC-EI50 (SY-XC-E150) | 1 |
| USB video converter | The Imagingsource, NC, USA | DFG/USB2-It | 1 |
| iFlySpy2 (fly tracking software) | Julian Brown, Stanford, Calfornia: julianrbrown@gmail.com | iFlySpy2 | 1 |
| IC Capture software | The Imagingsource, NC, USA | (http://www.theimagingsource.com/) | |
| Miscellaneous | (Quantity needed) | ||
| Dremel rotary tool | Dremel, Racine, WI, USA | Dremel 8000-03 | 1 |
| Diamond-coated drill bits for glass cutting | Available from various suppliers; MSC industrial Supply Co, Melville, NY | 90606328 | 1 |
