Summary
यह प्रोटोकॉल इमेजिंग प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके माइक्रोबियल ऑटोएग्रीगेशन को मापने के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण का वर्णन करता है।
Abstract
लाभकारी और प्रोबायोटिक बैक्टीरिया अपने मेजबानों में आवश्यक भूमिका निभाते हैं, संक्रामक रोगों के लिए प्रतिरक्षा सहित विभिन्न स्वास्थ्य लाभ प्रदान करते हैं। लैक्टोबैसिलेसी परिवार में प्रोबायोटिक गुणों की पुष्टि के साथ ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया होते हैं। यह अध्ययन सेलुलर एकत्रीकरण का अध्ययन करने में एकल-कोशिका उच्च थ्रूपुट विश्लेषण की प्रभावशीलता को प्रदर्शित करने के लिए एक मॉडल के रूप में लैक्टोबैसिलेसी प्रजातियों का उपयोग करता है। आहार से सरल कार्बोहाइड्रेट के लिए इन लाभकारी प्रजातियों की प्रतिक्रिया का विश्लेषण करने पर ध्यान केंद्रित किया गया है।
अध्ययन से पता चलता है कि इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री (आईएफसी) कार्बोहाइड्रेट की उपस्थिति और अनुपस्थिति में प्रोबायोटिक बैक्टीरिया के संयोजन में मूलभूत अंतर को कैसे दूर कर सकता है। IFC माइक्रोस्कोपी के स्थानिक संकल्प के साथ पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री की शक्ति और गति को जोड़ती है, लाभकारी जीवाणु उपभेदों और स्थितियों के पुस्तकालय में एक फेनोटाइपिक रूप से परिभाषित तरीके से उच्च दर जटिल मॉर्फोमेट्रिक माप को सक्षम करती है। यह प्रोटोकॉल लैक्टोबैसिलेसी प्रजातियों के ऑटोएग्रीगेशन में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और आहार कार्बोहाइड्रेट के प्रति उनकी प्रतिक्रिया पर प्रकाश डालता है, इन प्रोबायोटिक बैक्टीरिया के लाभकारी प्रभावों के पीछे तंत्र को समझने में योगदान देता है।
Introduction
बैक्टीरियल ऑटोएग्रीगेशन को बायोफिल्म निर्माण में एक प्राथमिक कदम माना जाता है। इस प्रक्रिया में (कभी-कभी ऑटोग्लूटिनेशन या फ्लोक्यूलेशन भी कहा जाता है), एक ही प्रकार के बैक्टीरिया बहुकोशिकीय गुच्छों का निर्माण करते हैं जो अंततः संस्कृति ट्यूबों के तल पर बस जाते हैं या उनके लक्ष्य ऊतक या सतह1 से जुड़ते हैं।
ऑटोएग्रीगेशन एक व्यापक रूप से देखी गई घटना है और अब तक ग्राम-नकारात्मक रोगजनकों जैसे अवसरवादी रोगज़नक़ एसिनेटोबैक्टर बाउमानी2, दंत रोगज़नक़ एग्रेगोबैक्टर एक्टिनोमाइसेटेमकोमिटन्स3, और उभरते रोगज़नक़ बर्कहोल्डरिया स्यूडोमैली4 में दिखाया गया है। ऑटोएग्रीगेशन को कई प्रोबायोटिक ग्राम-पॉजिटिवउपभेदों 5,6,7,8में भी वर्णित किया गया है। लैक्टोबैसिलस (एल) एसिडोफिलस में, ऑटोएग्रीगेशन आंशिक रूप से एस-लेयर प्रोटीन द्वारा मध्यस्थता किया गया था और जाइलन7 के लिए एक आसंजन के साथ सहसंबद्ध था। इसी तरह, हमें ग्लूकोज-निर्भर ऑटोएग्रीगेशन और चिपकने वाले गुणों के प्रेरण के बीच एक संबंध मिला (जैसा कि म्यूसिन के आसंजन द्वारा निर्णय लिया गया है) प्रोबायोटिक प्रजातियों लैक्टिकेसिबैसिलस रमनोसस जीजी, लैक्टिकेसिबैसिलस केसी, एल. एसिडोफिलस, लैक्टिकेसिबैसिलस पैराकेसी, और लैक्टिप्लांटिबैसिलस प्लांटरम5. वृद्धि हुई autoagagation सबसे अधिक संभावना ग्लूकोज और उसके catabolites9 के जवाब में सेलुलर आसंजनों की अभिव्यक्ति में परिवर्तन परिलक्षित होता है. जबकि स्वत: एकत्रीकरण के आणविक तंत्र निर्धारित किया जा करने के लिए रहते हैं, यह दिखाया गया है कि इस प्रक्रिया एकत्रित बैक्टीरिया के फेनोटाइप बदल जाता है और उन्हें पर्यावरण तनाव1, साथ ही कोरम संवेदन अणुओं10 के लिए वृद्धि हुई संवेदनशीलता के लिए बढ़ाया सहिष्णुता अनुदान.
ऑटोएग्रीगेशन को मापने के लिए कई दृष्टिकोणों का उपयोग किया गया है; एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण संस्कृतियों एक निश्चित समय के लिए संकीर्ण संस्कृति ट्यूबों में स्थिर खड़े जाने के लिए है. नियंत्रण संस्कृतियां अशांत रहती हैं, जबकि ऑटोएग्रीगेशन संस्कृतियां ट्यूब के निचले भाग में बस जाएंगी। एक अधिक मात्रात्मक दृष्टिकोण अवसादन या परख11 निपटाने से स्वत: एकत्रीकरण उपायों.
बैक्टीरियल ऑटोएग्रीगेशन की जांच के लिए हाल के वर्षों में फ्लो साइटोमेट्री को भी तेजी से नियोजित किया गया है। यह विधि आकार में लगभग 0.5 और 1000 माइक्रोन के बीच कणों का विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त है। एकल जीवाणु या गठित समुच्चय तरल पदार्थ में निलंबित कर रहे हैं, एक धारा में खिलाया, और एक11 के द्वारा एक पता लगाया जा सकता है. आगे बिखरे हुए प्रकाश रिकॉर्डिंग सेल या कुल के सापेक्ष आकार को मापने की अनुमति देता है. यह अपेक्षाकृत तेज़ और सीधा है लेकिन कई मापदंडों का पता नहीं लगा सकता है, जैसे कि कुल आकार या समुच्चय में कोशिकाओं की औसत संख्या। इसलिए, इस दृष्टिकोण को सूक्ष्म रूप से पूरक किया जा सकता है, जिससे अधिक मापदंडों को12 की जांच की जा सकती है। हालांकि, पारंपरिक माइक्रोस्कोपी समय लेने वाली है और इस तरह परीक्षण किए गए नमूनों की संख्या और विश्लेषण की सांख्यिकीय शक्ति को सीमित करती है। सामान्य में, इमेजिंग प्रवाह साइटोमेट्री पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री की तुलना में कई विशेषताएं प्रदान करती है, जैसे सेल आकृति विज्ञान और फेनोटाइप का एक साथ विश्लेषण, छवि-आधारित विश्लेषण का संचालन, दुर्लभ घटनाओं का पता लगाना और प्रवाह साइटोमेट्री डेटा13को मान्य करना। ये लाभ प्रवाह साइटोमेट्री की क्षमताओं को बढ़ाते हैं और सेल आबादी की अधिक विस्तृत परीक्षा की सुविधा प्रदान करते हैं।
यह अध्ययन लैक्टिक एसिड बैक्टीरिया (एलएबी) में ऑटोएग्रीगेशन की निगरानी के लिए इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री के लिए एक मूल्यवान प्रोटोकॉल प्रदान करता है। ये ग्राम-पॉजिटिव रॉड फैकल्टी एनारोबेस हैं और एलएबी समूह से संबंधित हैं। ये कुशल ग्लूकोज किण्वक कार्बोहाइड्रेट चयापचय14 के अपने मुख्य अंत उत्पाद के रूप में लैक्टिक एसिड उत्पन्न. ये बैक्टीरिया माइक्रोबायोम के लाभकारी कोर सदस्य हैं और स्वाभाविक रूप से मनुष्यों और जानवरों के जठरांत्र संबंधी मार्ग (जीआईटी) में पाए जाते हैं, साथ ही महिलाओं के मूत्रजननांगी पथ में15. इसलिए, उनके ऑटोएग्रीगेशन गुणों का सटीक लक्षण वर्णन उच्च जैव प्रौद्योगिकी और नैदानिक रुचि का है।
हमारे पिछले निष्कर्षों ने संकेत दिया कि ऑटोएग्रीगेशन का बेसल स्तर विभिन्न प्रोबायोटिक उपभेदों के बीच भिन्न होता है। यह विषमता कार्बन स्रोत के रूप में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न कार्बोहाइड्रेट से प्रभावित होतीहै 5. प्रोबायोटिक बैक्टीरिया की इस मौलिक संपत्ति को दूर करने के लिए, आहार से कार्बोहाइड्रेट के प्रभाव IFC का उपयोग कर एकल कोशिका स्तर पर autoaggregation पर नजर रखी गई. यह IFC आधारित दृष्टिकोण शक्ति और माइक्रोस्कोप के संकल्प के साथ पारंपरिक प्रवाह cytometers की गति को जोड़ती है. इसलिए, यह एक फेनोटाइपिक रूप से परिभाषित तरीके16,17 में उच्च दर जटिल morphometric माप की अनुमति देता है. इस दृष्टिकोण को अन्य प्रोबायोटिक और रोगजनक बैक्टीरिया तक बढ़ाया जा सकता है, जीन अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट संवाददाताओं के साथ संयुक्त, और विषम समुच्चय में विशिष्ट जीवाणु प्रजातियों की उपस्थिति और प्रचुरता की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल वाले उपभेद।
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Protocol
उदाहरण के रूप में Lacticaseibacillus rhamnosus GG (LGG) के लिए टेम्पलेट के साथ .ast फ़ाइल, पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 में प्रदान की गई है।
1. मीडिया की तैयारी
- निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए लैक्टोबैसिली एमआरएस शोरबा तैयार करें (विआयनीकृत पानी के 1 एल में 55 ग्राम) और लैक्टोबैसिली एमआरएस अगर प्लेटें 1.5% (डब्ल्यू / वी) अगर ( सामग्री की तालिकादेखें)। आटोक्लेव नसबंदी के बाद, माध्यम सीधे उपयोग करने के लिए तैयार है या 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- 50% (विआयनीकृत पानी के 1 एल में 15 ग्राम) ट्रिप्टिक सोया शोरबा ( टीएसबी) (सामग्री की तालिकादेखें), टीएसबी 1% (डब्ल्यू / वी) डी- (+) -ग्लूकोज और 1% (डब्ल्यू / वी) डी- (+) के साथ पूरक तैयार करें। संदूषण से बचने के लिए इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करना पसंद किया जाता है।
- ग्लूकोज के साथ एक बफर माध्यम के लिए, टीएसबी को 1% (डब्ल्यू / वी) डी- (+) - ग्लूकोज, पोटेशियम फॉस्फेट मोनोबैसिक के 5 एमएम पोटेशियम डिबासिक, और 100 एमएम एमओपीएस (3- (एन-मॉर्फोलिनो) प्रोपेन सल्फोनिक एसिड के साथ पूरक तैयार करें, सामग्री की तालिका) पीएच 7 देखें। फिर माध्यम को निष्फल करने के लिए आटोक्लेव।
2. नमूने तैयार करना
नोट: इस कदम में हमारे आहार से किण्वित या गैर-किण्वित चीनी के जवाब में सेलुलर एकत्रीकरण का मूल्यांकन शामिल है। नमूना तैयार करने की प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व चित्रा 1 में दर्शाया गया है.
- लैक्टोबैसिली एमआरएस शोरबा प्लेट (1.5% अगर) पर एक जमे हुए ग्लिसरॉल स्टॉक (50% ग्लिसरॉल) से लैक्टोबैसिलेसी तनाव को स्ट्रीक करें।
नोट: यहां प्रस्तुत उदाहरण प्रयोग में, लैक्टोबैसिलस एसिडोफिलस (एटीसीसी 4356), लैक्टिकेसिबैसिलस केसी (एटीसीसी 393), लैक्टिकेसिबैसिलस केसी सबस्प पैराकेसी (एटीसीसी बीएए -52), लैक्टिप्लांटिबैसिलस प्लांटारम (एटीसीसी 8014), और लैक्टिकेसिबैसिलस रमनोसस जीजी (एटीसीसी 53103) (एलजीजी) प्रोबायोटिक उपभेदों का उपयोग किया गया था। फर्मिक्यूट्स फाइलम के अतिरिक्त प्रोबायोटिक सदस्यों के लिए इस पद्धति का विस्तार करने के लिए, बैसिलस कोगुलान (एटीसीसी 10545) का चयन किया गया था। - स्थिर परिस्थितियों में कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात विकसित करें।
- एक एकल कॉलोनी के साथ लैक्टोबैसिली एमआरएस शोरबा के 5 एमएल टीका और स्थिर परिस्थितियों में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इसे बढ़ना.
- 50% ट्रिप्टिक सोया शोरबा (टीएसबी) के 3 एमएल में पिछले चरण (1:100) से सेल संस्कृति को पतला करें, टीएसबी 1% (डब्ल्यू / वी) डी- (+) -ग्लूकोज के साथ पूरक है, या टीएसबी 1% (डब्ल्यू / वी) डी- (+) के साथ पूरक है।
- स्थिर परिस्थितियों में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
- माध्यम में समान रूप से कोशिकाओं को मिलाकर नमूना तैयार करें, और धीरे-धीरे चरण 2.5 से सेल संस्कृति ट्यूब भंवर। धीरे टेस्ट ट्यूब पलटा जब तक पूरा मिश्रण जगह लेता है. 200-300 माइक्रोन को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
नोट: समुच्चय को तोड़ने से बचने के लिए नमूना को सोनिकेट नहीं करना आवश्यक है। 3.4 से 3.10 करने के लिए कदम से डेटा अधिग्रहण के दौरान, नमूने भी ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, जहां उदाहरण हो सकता है. यदि यह देखा जाता है कि नमूना बहुत धीमी गति से चल रहा है या बिल्कुल नहीं चल रहा है, तो कोई भी उपयुक्त ताजा माध्यम के साथ नमूने को पतला कर सकता है।
3. डेटा अधिग्रहण
- निर्माता द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों के अनुसार इमेजिंग फ्लो साइटोमीटर सेट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
- डार्कफील्ड माप के लिए 785 एनएम लेजर को 5 मेगावाट पर सेट करें (पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री में साइड स्कैटरिंग के बराबर, एसएससी के रूप में संक्षिप्त)। 0.9 के संख्यात्मक एपर्चर (N.A) वाले 60x लेंस का उपयोग करें, उच्च संवेदनशीलता का चयन करें और गति को कम पर सेट करें।
- किसी भी डेटा को इकट्ठा करने से पहले, एसएससी चैनल में अंशांकन मोती प्रवाह की स्थिरता सुनिश्चित करें। "fluidics" बॉक्स में खेलने बटन पर क्लिक करें और मनका छवियों की गुणवत्ता की जांच. मनके चित्र तेज और कुरकुरे दिखाई देने चाहिए।
- लोड बटन दबाएँ और धारक में एक नमूना (चरण 2.6 से) के साथ एक ट्यूब जगह है.
- "कार्यस्थान" बॉक्स में एक नया स्कैटरप्लॉट बनाएं। नया स्कैटरप्लॉट पर क्लिक करें और एसएससी चैनल तीव्रता के अनुरूप ब्राइटफील्ड चैनल में क्षेत्र का चयन करें। अंशांकन मोती है कि नमूना के साथ साधन में चलाने बहिष्कृत.
नोट: मोतियों को केवल बफर के साथ एक नमूना लोड करने और क्षेत्र बनाम पर मोतियों की पहचान करके बाहर रखा जा सकता है। एसएससी प्लॉट। फिर बहुभुज क्षेत्र बनाएं बटन का उपयोग करके मनका आबादी के चारों ओर एक गेट बनाएं। - "अधिग्रहण सेटिंग्स" बॉक्स में, नमूना नाम दर्ज करें, डेटा संग्रहण के लिए स्थान निर्दिष्ट करें, रिकॉर्ड करने के लिए जनसंख्या (मोतियों के बिना सभी कक्ष) चुनें और एकत्र किए जाने वाले ईवेंट की संख्या सेट करें। आमतौर पर, 10,000-20,000 घटनाएं पर्याप्त होती हैं।
- "अधिग्रहण" बॉक्स में स्थित रिकॉर्ड बटन पर क्लिक करें, और घटनाओं की निर्दिष्ट संख्या तक पहुंचने के बाद अधिग्रहण प्रक्रिया स्वचालित रूप से समाप्त हो जाएगी।
- ट्यूब को उतारने के लिए रिटर्न बटन पर क्लिक करें, और एक छोटी सी विंडो में संकेत मिलने पर होल्डर से ट्यूब को हटा दें।
- प्रत्येक नमूने के लिए 3.5-3.9 कदम दोहराएँ.
- बाद के दोहराव के लिए डेटा अधिग्रहण की एकरूपता बनाए रखने के लिए टेम्पलेट सहेजें।
4. डेटा विश्लेषण
- जनसंख्या से स्वतः एकत्रीकरण के प्रतिशत (%) को मापें।
- आईडीईएएस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इमेजिंग फ्लो साइटोमीटर पर प्राप्त डेटा का विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
- विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में (.rif) फ़ाइल लोड करके कच्ची फ़ाइल (.rif) से डेटा विश्लेषण फ़ाइल (.daf) बनाएँ. फ़ाइल बटन क्लिक करें और आवश्यक (.rif) फ़ाइल खोलें. खुली हुई विंडो में, उपयोग अधिग्रहण विश्लेषण पर क्लिक करें और फिर ठीक क्लिक करें।
- केंद्रित घटनाओं की पहचान करने के लिए ब्राइटफील्ड चैनल में ढाल आरएमएस (छवि विपरीत और फोकस का माप) का एक हिस्टोग्राम बनाएं। विश्लेषण क्षेत्र में, नया हिस्टोग्राम बटन क्लिक करें. "नया हिस्टोग्राम" विंडो में, विश्लेषण करने के लिए अधिग्रहण से जनसंख्या चुनें, और "एक्स अक्ष सुविधा" में, ब्राइटफील्ड चैनल के ग्रेडिएंट आरएमएस का चयन करें।
- गैर-केंद्रित घटनाओं (चित्रा 2 ए) को बाहर करने के लिए विश्लेषण क्षेत्र में लाइन क्षेत्र बनाएं बटन पर क्लिक करके एक गेट रखें।
नोट: आमतौर पर, "केंद्रित" लाइन क्षेत्र में उच्चतम ग्रेडिएंट आरएमएस स्कोर के साथ घटनाओं का 80% -90% शामिल होना चाहिए, लेकिन प्रत्येक प्रयोगात्मक सेटअप के लिए "इन-फोकस" कोशिकाओं के लिए विशिष्ट थ्रेसहोल्ड निर्धारित किया जाना चाहिए।
- गैर-केंद्रित घटनाओं (चित्रा 2 ए) को बाहर करने के लिए विश्लेषण क्षेत्र में लाइन क्षेत्र बनाएं बटन पर क्लिक करके एक गेट रखें।
- ब्राइटफील्ड चैनल के पहलू अनुपात (चौड़ाई को सबसे उपयुक्त दीर्घवृत्त की लंबाई से विभाजित) बनाम क्षेत्र (माइक्रोन2) का एक स्कैटरप्लॉट बनाएं। विश्लेषण क्षेत्र में नया स्कैटरप्लॉट बटन दबाएं। "नया स्कैटरप्लॉट" विंडो में, चरण 4.1.3 से केंद्रित जनसंख्या चुनें।
- x-अक्ष सुविधा के लिए ब्राइटफ़ील्ड चैनल का क्षेत्रफल और y-अक्ष सुविधा के लिए ब्राइटफ़ील्ड चैनल का पक्षानुपात चुनें। यह स्कैटरप्लॉट केंद्रित आबादी पर गेटिंग को बड़े माइक्रोबियल समुच्चय और श्रृंखलाओं से सिंगलेट्स और छोटे कुल घटनाओं को अलग करने की अनुमति देता है।
- इस scatterplot पर, एकत्रीकरण घटनाओं जनसंख्या के लिए क्षेत्र मूल्य और एकल और छोटे समुच्चय जनसंख्या (चित्रा 2B) के लिए एक और गेट के आधार पर आयत क्षेत्र बटन (या बहुभुज क्षेत्र बनाएँ) का उपयोग कर एक गेट ड्रा.
नोट: कुछ पृष्ठभूमि में, singlets से छोटे समुच्चय को अलग चुनौतीपूर्ण हो सकता है, तो वे एक ही गेट में जोड़ा जा सकता है. एक ही बड़ा समुच्चय और जंजीरों (चित्रा 3) पर लागू होता है. - गेटिंग रणनीति की विश्वसनीयता को सत्यापित करने के लिए प्रत्येक गेट के भीतर घटनाओं की छवियों की मैन्युअल रूप से समीक्षा और मूल्यांकन करें। यदि आवश्यक हो, तो गेट के लिए क्षेत्र मान समायोजित करें। "जनसंख्या" ड्रॉप-डाउन मेनू से समीक्षा की गई जनसंख्या का चयन करके ऐसा करें.
नोट: गेटिंग का कोई विशिष्ट क्षेत्र मूल्य नहीं है, क्योंकि यह विश्लेषण किए जा रहे बैक्टीरिया की विशेषताओं के आधार पर भिन्न हो सकता है। - डेटा विश्लेषण को टेम्पलेट के रूप में सहेजें. फ़ाइल टैब क्लिक करें, Template.ast के रूप में सहेजें का चयन करें और डेटा विश्लेषण फ़ाइल (.daf) (LGG के लिए एक उदाहरण के रूप में .ast फ़ाइल का समर्थन) बनाने के लिए उसी टेम्पलेट के अंतर्गत अगला नमूना (.rif) फ़ाइल खोलें.
- आगे के विश्लेषण के लिए प्रमुख घटनाओं की गणना करने के लिए एक सांख्यिकी तालिका बनाएं। रिपोर्ट टैब पर क्लिक करें, फिर आंकड़े रिपोर्ट परिभाषित करें पर क्लिक करें।
- नई विंडो में, स्तंभ जोड़ें पर क्लिक करें. सिंगलेट्स/एग्रीगेट काउंट और % गेटेड आँकड़े जोड़ें। "सांख्यिकी" के अंतर्गत, %gated/count चुनें और चयनित जनसंख्या के अंतर्गत, एकल/समुच्चय चुनें. सूची में आँकड़े जोड़ने और उसे टेम्पलेट के रूप में सहेजने के लिए आँकड़े जोड़ें पर क्लिक करें.
- Generate statistic report पर क्लिक करें और विश्लेषण के लिए statistic template और (.daf) files चुनें।
- समुच्चय के आकार वितरण को मापें।
- एकत्रीकरण घटनाओं का मतलब आकार का विश्लेषण करने के लिए, कदम 4.1.5 (चित्रा 2 सी) से एकत्रीकरण घटनाओं की आबादी के क्षेत्र (माइक्रोन2) का एक हिस्टोग्राम प्लॉट करें।
- डेटा विश्लेषण को टेम्पलेट के रूप में सहेजें. फ़ाइल टैब पर क्लिक करें, टेम्पलेट के रूप में सहेजें का चयन करें, और डेटा विश्लेषण फ़ाइल (.daf) के लिए समान टेम्पलेट के अंतर्गत अगला नमूना (.rif) फ़ाइल खोलें।
- दोहराएँ कदम 4.1.7-4.19. समुच्चय के आकार के लिए, आँकड़ों के अंतर्गत माध्य चुनें और चयनित जनसंख्या के अंतर्गत समुच्चय का चयन करें. सुविधाओं के तहत, ब्राइटफ़ील्ड चैनल का क्षेत्र चुनें। सूची में आँकड़ा जोड़ने और इसे टेम्पलेट के रूप में सहेजने के लिए आँकड़े जोड़ें पर क्लिक करें।
- एक आँकड़ा रिपोर्ट जनरेट करने के लिए चरण 4.1.9 दोहराएँ।
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Representative Results
परिणाम बताते हैं कि यह विधि एलएबी बैक्टीरिया में आहार शर्करा के जवाब में ऑटोएग्रीगेशन में अंतर को आसानी से माप सकती है। समुच्चय से व्यक्तियों को अलग करके, विधि आहार से किण्वित या गैर-किण्वित शर्करा के जवाब में सभी घटनाओं से एकत्रीकरण घटनाओं की आबादी के प्रतिशत की गणना करने की अनुमति देती है। इसके अतिरिक्त, यह मापना संभव था कि उपचार के बीच कुल आबादी के औसत आकार में अंतर है या नहीं।
चित्रा 3 में प्रतिनिधि छवियों प्रत्येक लैब जीवाणु के लिए गेटिंग रणनीति का प्रदर्शन. एलजीजी और एल पैराकेसी में, एकल कोशिकाओं, छोटे समुच्चय, बड़े समुच्चय और श्रृंखलाओं का पता चला था(चित्रा 3)। हालांकि, चेन और बड़े समुच्चय को अलग नहीं किया जा सका।
चित्रा 4 में प्रतिनिधि छवियों ने किण्वित या गैर-किण्वित शर्करा के जवाब में प्रस्तुत विभिन्न एलएबी उपभेदों के बीच एकत्रीकरण विशेषताओं में पर्याप्त भिन्नता का खुलासा किया, जिन्हें जनसंख्या प्रतिशत और एकत्रीकरणघटनाओं के औसत आकार से मापा गया था।
चित्रा 1: नमूना तैयार करने की प्रक्रिया का कार्यप्रवाह। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एकत्रीकरण घटनाओं जनसंख्या और आकार के मूल्यांकन के लिए गेटिंग रणनीति। (ए) ब्राइटफील्ड चैनल का उपयोग करके ग्रेडिएंट आरएमएस के आधार पर सभी घटनाओं से केंद्रित घटनाओं की गेटिंग। (बी) ब्राइटफील्ड चैनल के पहलू अनुपात (सबसे उपयुक्त दीर्घवृत्त की लंबाई से विभाजित) बनाम क्षेत्र (माइक्रोन2) की साजिश रचकर बड़े समुच्चय से एकल और छोटे समुच्चय को अलग करना। (सी) एकत्रीकरण घटनाओं के बीच ब्राइटफील्ड चैनल का क्षेत्र कणों के आकार के बारे में जानकारी प्रदान करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: गेटिंग रणनीति की सेल छवियों. (ए) एलजीजी। (बी) टीएसबी (नियंत्रण) में एल पैराकेसी । कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: विभिन्न परिस्थितियों में एकत्रीकरण घटनाओं की प्रतिनिधि ब्राइटफील्ड छवियां। (ए) एलजीजी। (बी) एल। (सी) एल प्लांटरम। (डी) एल। शर्तों में टीएसबी मध्यम (नियंत्रण), ग्लूकोज और रैफिनोज (1% डब्ल्यू / वी) के साथ पूरक टीएसबी माध्यम और ग्लूकोज (1% डब्ल्यू / वी) और बफर के साथ पूरक टीएसबी माध्यम शामिल हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: उदाहरण के तौर पर LGG के लिए टेम्पलेट के साथ .ast फ़ाइल. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
फ्लो साइटोमेट्री यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रतिदीप्ति तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली विधि है, लेकिन यह उनके बड़े आकार या छोटे समुच्चय के कारण बैक्टीरिया कोशिकाओं के लिए सटीक माप प्रदान नहीं कर सकती है। ये कारक ऑटोएग्रीगेशन के सटीक परिमाणीकरण और विभिन्न स्थितियों में कुल गठन के बेसल स्तर को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित कर सकते हैं। इसे संबोधित करने के लिए, इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री (आईएफसी) को बेहतर संकल्प प्राप्त करने के लिए नियोजित किया गया था कि कार्बोहाइड्रेट प्रोबायोटिक बैक्टीरिया के एकत्रीकरण को कैसे प्रभावित करतेहैं 5. आईएफसी प्रति नमूना कई डिजिटल छवियों को इकट्ठा करके और संख्यात्मक छविआधारित सुविधाओं को निकालने के द्वारा मानक माइक्रोस्कोपी की प्रति सेल सूचना सामग्री के साथ पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री में बड़े नमूना आकारों के सांख्यिकीय महत्व को जोड़ती है।
इससे पहले, आईएफसी इस तरह के बेसिलस subtilis में एंटीबायोटिक उत्पादन और दोहरी प्रजातियों बायोफिल्म18,19 की संरचना के रूप में विभिन्न जीवाणु व्यवहार, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. जबकि स्वत: एकत्रीकरण को मापने के लिए इमेजस्ट्रीम प्रवाह साइटोमेट्री का छिटपुट उपयोग20 की सूचना दी गई है, यह प्रोबायोटिक बैक्टीरिया5 का अध्ययन करने में इसकी उपयोगिता का पहला प्रदर्शन माना जाता है। निष्कर्ष बताते हैं कि आईएफसी कुशल और विश्वसनीय है, जो एलएबी उपभेदों के माइक्रोबियल एकत्रीकरण का अध्ययन करने में पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी दोनों के प्रतिस्थापन के रूप में कार्य करता है, विशेष रूपसे उपभेदों के बीच ऑटोएगेशन के बेसल स्तरों में महत्वपूर्ण अंतर को देखते हुए। यह दृष्टिकोण कई उपभेदों और विकास स्थितियों की सटीक उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए विशेष रूप से मूल्यवान है।
हालाँकि, IFC-आधारित पद्धति की कुछ सीमाएँ और विचार हैं। पारंपरिक माइक्रोस्कोपी विधियों की तुलना में डेटा सेट उत्पन्न करने के लिए अधिक संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, IFC छवियों के ऑप्टिकल और डिजिटल संकल्प विधि के निहित गुणों के कारण पारंपरिक माइक्रोस्कोपी की तुलना में अपेक्षाकृत कम है. जबकि पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री में ऑप्टिकल स्कैन की विश्वसनीयता और गुणवत्ता आश्वासन का अभाव होता है, इमेजस्ट्रीम फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग आमतौर पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के बजाय पारंपरिक प्रवाह साइटोमेट्री के विकल्प के रूप में किया जाता है। इसके अलावा, क्षेत्र मूल्य का निर्धारण करना जो एकल कोशिकाओं को समुच्चय से अलग करता है, एक महत्वपूर्ण कदम है, और महत्वपूर्ण डेटा खोने से बचने के लिए इसकी सटीक पहचान महत्वपूर्ण है। जैसा कि प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, इस मूल्य जीवाणु प्रजातियों भर में भिन्न होता है और ध्यान से निर्धारित किया जाना चाहिए.
विधि के अनुप्रयोग का विस्तार करने के लिए आगे के विकास किए जा सकते हैं, जैसे कि अतिरिक्त पर्यावरणीय कारकों के तहत एकत्रीकरण की जांच करना। प्रवाह साइटोमेट्री डेटा के साथ छवि विश्लेषण का संयोजन आकार, आकार और संरचना सहित माइक्रोबियल समुच्चय के अधिक व्यापक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है। इस विधि को स्वाभाविक रूप से होने वाले जलीय आवासों21 में माइक्रोबियल समुच्चय के उच्च-थ्रूपुट लक्षण वर्णन को बढ़ाने के लिए भी लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, इसे लक्ष्य प्रजातियों और सेल प्रकारों को लेबल करके जटिल माइक्रोबायोम समुदायों में एकत्रीकरण की जांच करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।
कुल मिलाकर, निष्कर्ष इस बात पर प्रकाश डालते हैं कि यह दृष्टिकोण मोनो-प्रजातियों और जटिल समुदायों दोनों में बैक्टीरिया के एकत्रीकरण गुणों के मूल्यांकन के लिए सीधा, सूचनात्मक और अत्यधिक उपयोगी है। यह कोशिकाओं की संख्या और विभिन्न विलोपन, अतिअभिव्यक्ति उपभेदों और विभिन्न रासायनिक और भौतिक जोड़तोड़ के बीच समुच्चय के आकार की तुलना करके ऑटोएग्रीगेशन अंतर्निहित आणविक तंत्र की बेहतर समझ को सक्षम बनाता है।
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Disclosures
कोई नहीं।
Acknowledgments
इस काम को इज़राइली साइंस फाउंडेशन (ग्रांट 119/16) और आईएमओएच ग्रांट (3-15656) द्वारा आईकेजी को समर्थित किया गया था। आर.एस. क्रेटमैन फैलोशिप द्वारा समर्थित।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 mL culture tubes | Falcon | 352051 | |
| 15 mL centrifuge tube | Falcon | 352096 | |
| Bacto Agar | Baeton,Dickinson and Company | 214010 | |
| Bacto Typtic Soy Broth | Baeton,Dickinson and Company | 211825 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| D-(+)-Raffinose pentahydrate | Sigma | 83400-25G | |
| Difco Lactobacilli MRS broth | Baeton,Dickinson and Company | 288130 | |
| EASY-LOCK MICROPR. 1.5 mL (Eppendorf) | FL medical | 23053 | |
| IDEAS Software | Amnis/EMD Millipore | N/A | Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150212_144049?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1 |
| ImageStream X Mark II | Amnis/EMD Millipore | N/A | Details available at: https://www.merckmillipore.com/INTL/en/20150121_205948?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F |
| MOPS, 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid | Fisher bioreagents | BP308-500 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific, 174.18 g/mol | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma, 136.09 g/mol | P0662-500G |
References
- Trunk, T., Khalil, H. S., Leo, J. C.
- Ishikawa, M., Nakatani, H., Hori, K. AtaA, a new member of the trimeric autotransporter adhesins from Acinetobacter sp. Tol 5 mediating high adhesiveness to various abiotic surfaces. PLoS One. 7, e48830 (2012).
- Inoue, T., et al. Molecular characterization of low-molecular-weight component protein, Flp, in Actinobacillus actinomycetemcomitans fimbriae. Medical Microbiology and Immunology. 42 (4), 253-258 (1998).
- Boddey, J. A., Flegg, C. P., Day, C. J., Beacham, I. R., Peak, I. R. Temperature-regulated microcolony formation by Burkholderia pseudomallei requires pilA and enhances association with cultured human cells. Infection and Immunity. 74 (9), 5374-5381 (2006).
- Suissa, R., et al. Context-dependent differences in the functional responses of Lactobacillaceae strains to fermentable sugars. Frontiers in Microbiology. 13, 949932 (2022).
- Isenring, J., Geirnaert, A., Lacroix, C., Stevens, M. J. A. Bistable auto-aggregation phenotype in Lactiplantibacillus plantarum emerges after cultivation in in vitro colonic microbiota. BMC Microbiology. 21, 268 (2021).
- Kos, B., et al. Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92. Journal of Applied Microbiology. 94 (6), 981-987 (2003).
- Zommiti, M., et al. In vitro assessment of the probiotic properties and bacteriocinogenic potential of Pediococcus pentosaceus MZF16 isolated from artisanal tunisian meat "Dried Ossban". Frontiers in Microbiology. 9, 2607 (2018).
- Suissa, R., et al. Metabolic rewiring of the probiotic bacterium rhamnosus GG contributes to cell-wall remodeling and antimicrobials production. bioRxiv. , (2023).
- Connell, J. L., Kim, J., Shear, J. B., Bard, A. J., Whiteley, M. Real-time monitoring of quorum sensing in 3D-printed bacterial aggregates using scanning electrochemical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (51), 18255-18260 (2014).
- Misawa, N., Blaser, M. J. Detection and characterization of autoagglutination activity by Campylobacter jejuni. Infection and Immunity. 68 (11), 6168-6175 (2000).
- Sherlock, O., Schembri, M. A., Reisner, A., Klemm, P. Novel roles for the AIDA adhesin from diarrheagenic Escherichia coli: cell aggregation and biofilm formation. Journal of Bacteriology. 186 (23), 8058-8065 (2004).
- Wang, Y., et al. Metabolism characteristics of lactic acid bacteria and the expanding applications in food industry. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 612285 (2021).
- Turroni, F., et al. Molecular dialogue between the human gut microbiota and the host: a Lactobacillus and Bifidobacterium perspective. Cellular and Molecular Life Sciences. 71, 183-203 (2014).
- Zuba-Surma, E. K., Kucia, M., Abdel-Latif, A., Lillard, J. W. Jr, Ratajczak, M. Z. The ImageStream System: a key step to a new era in imaging. Folia Histochemica et Cytobiologica. 45, 279-290 (2007).
- Dashkova, V., Malashenkov, D., Poulton, N., Vorobjev, I., Barteneva, N. S. Imaging flow cytometry for phytoplankton analysis. Methods. 112, 188-200 (2017).
- Maan, H., Gilhar, O., Porat, Z., Kolodkin-Gal, I. Bacillus subtilis colonization of arabidopsis thaliana roots induces multiple biosynthetic clusters for antibiotic production. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 722778 (2021).
- Maan, H., et al. Imaging flow cytometry reveals a dual role for exopolysaccharides in biofilms: To promote self-adhesion while repelling non-self-community members. Computational and Structural Biotechnology Journal. 20, 15-25 (2022).
- Konieczny, M., Rhein, P., Czaczyk, K., Bialas, W., Juzwa, W. Imaging flow cytometry to study biofilm-associated microbial aggregates. Molecules. 26 (23), 7096 (2021).
- Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics. Nature Microbiology. 1, 16178 (2016).
