RhoC GTPase Assay Activation
Summary
פרוטוקול זה מנצל לנתץ assay כדי לקבוע את רמות של GTPase RhoC פעיל בתוך התאים.
Abstract
RhoC GTPase יש הומולוגיה 91% ל RhoA GTPase. בגלל השכיחות שלה בתאים, ריאגנטים רבים וטכניקות RhoA GTPase פותחו. עם זאת, RhoC GTPase מתבטא תאים סרטניים עם גרורות ברמות נמוכות יחסית. לכן, כמה RhoC ספציפי ריאגנטים פותחו. יש לנו להתאים assay ההפעלה Rho GTPase כדי לזהות RhoC. טכניקה זו משתמשת GST-Rho תחום מחייב היתוך חלבון לשלוף פעיל GTPase RhoC. בנוסף, אנחנו יכולים לקצור חלבון הכולל בתחילת assay כדי לקבוע רמות בסך הכל (GTP והתוצר כבול) GTPase RhoC. זה מאפשר להגדרה של GTPase RhoC פעיל לעומת סך בתא. כמה גירסאות מסחריות של הליך זה פותחו עם זאת, ערכות המסחרי מותאמים RhoA GTPase ובדרך כלל אינם פועלים היטב עבור RhoC GTPase. חלקים של assay שונו, כמו גם פיתוח של נוגדנים RhoC ספציפי.
Protocol
Discussion
השלב הקריטי ביותר של ההליך הוא דור של טרי GST-RBD. אי לשים לב בשלב זה היא הסיבה העיקרית לכישלון. כל המדרגות, מדור של GST-RBD (1.2) כדי הדגירה לילה עם lysate התא (2.5), צריך להיעשות ביום אחד. צעד נוסף הוא חיוני כדי לוודא שיש מספיק תאים כדי להפיק את lysates התא. זו היא בעלת חשיבות מיוחדת כאשר …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחלקת הביטחון W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 ו W81XWH-08-1-0356
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | ||
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | BioRad | 345-0032 |
References
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L. W., Merajver, S. D. RhoC GTPase, a novel transforming oncogene for human mammary epithelial cells that partially recapitulates the inflammatory breast cancer phenotype. Cancer Res. 60 (20), 5832-5838 (2000).
- van Golen, K. L., Wu, Z. F., Qiao, X. T., Bao, L., Merajver, S. D. RhoC GTPase overexpression modulates induction of angiogenic factors in breast cells. Neoplasia. 2 (5), 418-425 (2000).
- Golen, K. L. v. a. n. Reversion of RhoC GTPase-induced inflammatory breast cancer phenotype by treatment with a farnesyl transferase inhibitor. Mol Cancer Ther. 1 (8), 575-583 (2002).
- Golen, K. L. v. a. n. Mitogen activated protein kinase pathway is involved in RhoC GTPase induced motility, invasion and angiogenesis in inflammatory breast cancer. Clin Exp Metastasis. 19 (4), 301-311 (2002).
- Yao, H., Dashner, E. J., van Golen, C. M., van Golen, K. L. RhoC GTPase is required for PC-3 prostate cancer cell invasion but not motility. Oncogene. 25 (16), 2285-2296 (2006).
- Hall, C. L. Type I Collagen receptor (alpha2beta1) signaling promotes prostate cancer cell invasion through RhoC GTPase. Neoplasia. 10 (8), 797-803 (2008).
- Sequeira, L., Dubyk, C. W., Riesenberger, T. A., Cooper, C. R., van Golen, K. L. Rho GTPases in PC-3 prostate cancer cell morphology, invasion and tumor cell diapadesis. Clin Exp Metastasis. 25, 569-579 (2008).
- van Golen, K. L. CCL2 Induces Prostate Cancer Transendothelial Cell Migration via Activation of the Small GTPase Rac. J Cell Biochem. 104, 1587-1597 (2008).
- Chatterjee, M., van Golen, K. L. . Int J Cancer. , (2010).
- Sander, E. E., ten Klooster, J. P., van Delft, S., van der Kammen, R. A., Collard, J. G. Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior. J Cell Biol. 147 (5), 1009-1022 (1999).
