RHOC GTPasa ensayo de activación
Summary
Este protocolo utiliza un desplegable de ensayo para determinar los niveles de GTPasa RHOC activa dentro de las células.
Abstract
RHOC GTPasa tiene 91% de homología con RhoA GTPasa. Debido a su prevalencia en las células, muchos reactivos y técnicas para la GTPasa RhoA se han desarrollado. Sin embargo, RHOC GTPasa se expresa en las células del cáncer metastásico en niveles relativamente bajos. Por lo tanto, son pocos los RHOC reactivos específicos se han desarrollado. Hemos adaptado un ensayo de activación de Rho GTPasa para detectar RHOC. Esta técnica utiliza una GST-Rho de unión a proteínas de fusión de dominio para sacar activos GTPasa RHOC. Además, se puede cosechar la proteína total en el comienzo de la prueba para determinar los niveles del total (GTP y GDP unido) GTPasa RHOC. Esto permite la determinación de la GTPasa RHOC activa respecto al total de la celda. Varias versiones comerciales de este procedimiento se han desarrollado sin embargo, los equipos comerciales se han optimizado para RhoA GTPasa y por lo general no funcionan bien para RHOC GTPasa. Partes de la prueba han sido modificados, así como el desarrollo de un anticuerpo específico RHOC.
Protocol
Discussion
El paso más crítico del proceso es la generación de nuevas GST-RBD. No prestar atención a este paso es la razón principal del fracaso. Todos los pasos, desde la generación de la GST-RBD (1,2) a la incubación durante la noche con el lisado celular (2,5), se debe hacer en un solo día. Otro paso importante es asegurarse que hay suficientes células para producir los lisados celulares. Esto es de particular importancia cuando se mira en RHOC GTPasa, que tiende a estar presente en bajos niveles en la célula.
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Departamento de Defensa W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 y W81XWH-08-1-0356
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Gluthione-sepharose 4B beads | GE Healthcare | 17-0756-01 | ||
| Criterion 4-20% Tris-HCl gels | BioRad | 345-0032 |
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