Этот протокол используется выпадающее анализ, чтобы определить уровень активной RhoC ГТФ внутри клеток.
Abstract
RhoC GTPase имеет 91% гомологию с RhoA ГТФ. Из-за своей распространенности в клетках, многие реактивы и методики RhoA GTPase были разработаны. Тем не менее, RhoC GTPase выражается в метастатические раковые клетки при относительно низких уровнях. Таким образом, несколько RhoC-специфических реагентов были разработаны. Мы адаптировали анализа Rho активации для обнаружения RhoC ГТФ. Эта техника использует GST-связывающий белок Rho слияние домена вытащить активных GTPase RhoC. Кроме того, мы можем урожай общего белка в начале анализа для определения уровня общего (ГТФ и ВВП граница) RhoC ГТФ. Это позволяет для определения активной по сравнению с общим RhoC ГТФ в клетке. Несколько коммерческих версий этой процедуры были разработаны однако, коммерческие наборы, оптимизированные для RhoA ГТФ и, как правило, не работают хорошо для RhoC ГТФ. Части анализа были изменены, а также развитие RhoC-специфических антител.
Protocol
1. Подготовка GST-синтез белка Глицерин запасы JM109 компетентных бактерий содержащий первые N-терминал 90 аминокислот rhotekin Rho связывающий домен (РосБР) субклонировали BamH1/EcoR1 pGEX3x вектора сделаны. Чтобы убедиться в высокой эффективности следующие шаги должны быть выполнены для к…
Discussion
Наиболее критичным этапом процедуры является генерация свежих GST-РосБР. Невыполнение обратить пристальное внимание на этот шаг является основной причиной для отказа. Все шаги, от поколения GST-RBD (1.2) для инкубации в течение ночи с Клеточный лизат (2,5), должно быть сделано в течение одного ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Кафедра обороны W81XWH-05-1-0005, W81XWH-06-1-0495, W81XWH-08-1-0029 и W81XWH-08-1-0356