Summary
Активности индуцибельной лизина декарбоксилазы контролируется путем взаимодействия подложки L-лизина и кадаверина продукт с 2,4,6-trinitrobenzensulfonic кислотой с образованием аддуктов, которые дифференциальных растворимость в толуоле.
Abstract
Кишечная палочка является кишечных бактерий, которые способны растущих в широком диапазоне рН (рН 5 - 9) 1 и, невероятно, способен выжить крайне кислоты подчеркивает, включая проход через млекопитающих желудок, где рН может опуститься до как рН 1 - 2 2. Чтобы включить такой широкий ассортимент кислотных выживания рН, Е. палочка обладает четырьмя различными индуцибельной аминокислот декарбоксилазы кислоту, которая декарбоксилирование субстрата их аминокислот в протон-зависимым образом повышая внутренние рН. Декарбоксилазы включают декарбоксилазы глутаминовой кислоты Гада и GadB 3, аргинин декарбоксилазы Adia 4, лизин декарбоксилазы LdcI 5, 6 и орнитиндекарбоксилазы SPEF 7. Все эти ферменты используют пиридоксаль-5'-фосфат в качестве со-фактор 8 и функционировать вместе с внутренней мембраны субстрат-продукт антипортеры, которые удаляют декарбоксилирования продукции на внешнем носителе, в обмен на свежий субстрат 2. В случае LdcI, лизин-кадаверин антипортера называется CadB. Недавно мы определили рентгеновского кристаллической структуры LdcI до 2,0 Å, и мы обнаружили, роман малые молекулы связаны с LdcI строгие гуанозин регулятор ответа 5'-дифосфат, 3'-дифосфат (ppGpp) 14. Строгий ответ возникает, когда экспоненциально растущих клеток опыт питательных лишения или один из ряда других напряжений 9. В результате клетки производят ppGpp что приводит к сигнальный каскад кульминацией переход от экспоненциального роста к стационарным фазе роста 10. Мы показали, что ppGpp является специфическим ингибитором LdcI 14. Здесь мы опишем лизина анализа декарбоксилазы, модифицированный из анализа разработан Фан соавт. 11, которые мы использовали для определения активности LdcI и эффект pppGpp / ppGpp на эту деятельность. Реакция LdcI декарбоксилирования удаляет α-карбоксильной группы L-лизина и производит углекислый газ и полиаминов кадаверин (1,5-diaminopentane) 5. L-лизина и кадаверина может реагировать с 2,4,6-trinitrobenzensulfonic кислоты (TNBS) при высоких рН для получения N, N-bistrinitrophenylcadaverine (ТНП-кадаверин) и N, N-bistrinitrophenyllysine (ТНП-лизин), соответственно 11. ТНП-кадаверин могут быть отделены от ТНП-лизин, как бывший растворим в органических растворителях, таких как толуол в то время как последняя не является (см. Рисунок 1). Линейный диапазон анализа был определен эмпирически с использованием очищенных кадаверин.
Protocol
1) Реактивы и оборудование
- Во-первых, подготовить следующие три решения: 1 мл раствора которого состоит из 8 мМ L-лизин, 100 ммоль натрия 2 - (N-морфолино) ethanesulphonic кислоты (MES), рН 6,5, 0,2 мМ нуклеотид, где нуклеотид либо: гуанозин дифосфат (ВВП), гуанозин трифосфата (ГТФ), гуанозин-5'-дифосфат, 3'-дифосфат (ppGpp), или гуанозин-5'-трифосфата, 3'-дифосфат (pppGpp), 0,1 мМ пиридоксаль-5'-фосфат (ПЛП), и 1 мМ β-меркаптоэтанол / (β-ME). 1 мл раствора В, состоящий из 100 ммоль натрия МЧС рН 6,5, 0,1 мМ ПЛП, 1 мМ β-ME и 50 нМ LdcI. LdcI очищали, как описано в Снайдер и др. 6. Kanjee и соавт. 14.
1 мл раствора С, который является идентичным Раствор В, но не содержит LdcI. - Подготовка 100 мл универсальное решение, состоящее из 1 М карбонат натрия (10,6 г/100 мл) и аликвоту 50 мкл в каждую лунку 96-луночного полистирола пластины с использованием многоканальной пипетки. Добавить 30 мкл воды к пластине, а затем крышку. Обратите внимание, что сумма объема добавленной воды и объем образца извлеченных во время ферментативной реакции должна быть равна 50 мкл. В этом случае, 20 мкл образца фермента реакция будет удален.
- Подготовка 5 мл раствора TNBS в 10 мМ путем разбавления 294 мкл 5% (м / о) TNBS акции с 4706 мкл воды, заверните в алюминиевую фольгу и хранить на льду.
- Равновесия Термостат Эппендорф Plus при температуре 37 ° C. Термостат Plus имеет 24 скважин в 6 колонн. На рисунке 2 схематично. Этикетка 1,5 мл Eppendorf труб с указанием идентичности нуклеотидных, что будет проверяться (по одному на колонку): GTP (столбец), ВВП (колонка Б), ppGpp (столбец С), pppGpp (столбец D), не нуклеотидных (столбец E ), а белок образцы (столбец F).
- Стойка несколько коробок с 200 мкл советы, что каждый альтернативный строки опущены дает в общей сложности четыре ряда советов. Это необходимо для использования многоканальной пипетки с термостатом Плюс heatblock во фермента анализа.
- Равновесия Цифровой Heatblock (VWR) при 42 ° C.
- Место 96-луночного 2,0 мл полипропиленовые пластины на льду, чтобы охладиться.
2) LdcI Пробирной
- Алиготе 50 мкл раствора с соответствующей нуклеотидной до 1,5 мл Eppendorf труб в каждом из пяти колонн Термостат Эппендорф.
- Добавить 330 мкл раствора В-три трубы в колонке F и добавляют 330 мкл раствора С (не-белковые контроля) до окончательного трубки в колонке F.
- Равновесия растворов при 37 ° С в течение пяти минут. Совет: после 5 минут, отрезали шапки труб в центре нагрева блока, чтобы предотвратить их от вмешательства в многоканальной пипетки, которые будут использоваться дальше.
- Использование мкл 5-50 VWR многоканальной пипетки, трансфер 50 мкл из трубы в колонке F в каждой из труб в колонках AE. Начало таймер, как только первые трубки носит смешанный характер.
- На 2, 4 и 6 минут удалить 20 мкл образца с помощью многоканальной пипетки и добавить в универсальное решение.
- Примечание: образцы в универсальное решение может быть покрыта в пищевую пленку и замораживали при -20 ° C для последующей обработки. Плиты должны быть разморозить при комнатной температуре до реакции с TNBS.
3) TNBS реакция и цвет развитию
- Добавить 50 мкл 10 мМ TNBS решение остановить решение с помощью многоканальной пипетки, а затем инкубируют при 42 ° С в течение 6 минут. Решение станет темно-желтый / оранжевый цвет TNBS реагирует с лизина и кадаверина.
- Через 6 минут, охладить пластины на лед, чтобы замедлить реакцию.
- Удалить 100 мкл образца с помощью VWR 20-200 мкл многоканальные пипетки и место в 2 мл глубокий колодец пластина, охлаждали на льду. Передача льда ведро fumehood.
- Добавить 500 мкл толуола в каждую лунку использованием HandyStep (Brand) пипетка повторить и 12,5 мл пипетки (Plastibrand).
- Вытрите лишнюю толуол использованием kimwipe и покрывают пластины полосками упаковочной ленты. Убедитесь, что нажали вниз твердо получить хорошее уплотнение. Обложка 96-луночного планшета с плоской крышкой и энергично встряхивают в течение 1 минуты и 30 секунд.
- Оставить решение согласиться на 5 минут. ТНП-кадаверин сейчас находится в верхней толуол фазы, а ТНП-лизина остается растворимый в воде (см. Рисунок 1).
- Удалить 200 мкл толуола использованием 20-200 мкл многоканальной пипетки в 96-луночный планшет для чтения. Примечание: не забудьте проверить, что каждый образец удаляется ясно и не имеет какого-либо из нижней водной фазы. Примечание: используйте советы барьер, чтобы предотвратить повреждение многоканальные пипетки на толуол.
- Считать абсорбцию при 340 нм в SpectraMax 340 ридер.
- Для очистки кварцевой пластинки, промыть толуола с водой и поставьте кварцевой пластиной в большомстеклянный поднос в вытяжном шкафу. Залить 100 мл 7:03 смеси 70% (объем / объем) азотной кислоты: 95% (объем / объем) этанола и охватывают кварцевой пластинки со вторым стеклянный поднос. Внимание: Реакция сильно экзотермическая, а иногда и взрывных носить соответствующую защиту и гарантировать, что дыма створку капота установлен в нижнем 6 "Уровень После охлаждения промывают азотной кислоты с водой, а затем 95% этанола..
4) Результаты представитель
1) кадаверин калибровочной кривой (рис. 3)
Анализ проводили, как описано, но без каких-либо L-лизина или LdcI и вместо различных концентраций кадаверин были использованы для эмпирически определить линейный диапазон анализа. Анализ был линейным, чтобы OD 340 в размере 0,25, что соответствует ~ 22 нмоль кадаверина (рис. 3).
2) Деятельность LdcI (рис. 4)
Деятельность LdcI только была определена в 153,5 (± 18,1) нмоль кадаверин мин-1 мкг LdcI-1 при рН 6,5. Деятельность LdcI не влияет в присутствии 100 мкМ ГТФ или ВВП, но сильно тормозится (> 10 раз) в присутствии pppGpp и ppGpp (рис. 4).
Рисунок 1. Принципиальная схема реакции LdcI. Декарбоксилирования реакции L-лизина для генерации СО 2 и кадаверин показано, а также последующая реакция с TNBS при высоком рН для получения N, N-bistrinitrophenylcadaverine (ТНП-кадаверин) и N, N '-bistrinitrophenyllysine (ТНП-лизина). На основе Фан и др. al.11
Рисунок 2. Настройка термостата Эппендорф. Расположения образцов в 24-луночных Термостат Эппендорф показан вместе с описанием шагов анализа (выделены жирным шрифтом). Стрелки показывают передачи реакция решения в соответствии с протоколом. Удаление реакция решение остановить решение в 96-луночного планшета также указано.
Рисунок 3. Кадаверин стандартной кривой. Участок абсорбции при длине волны 340 нм по сравнению с нмоль кадаверина показано. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение по крайней мере трех независимых измерений. Линия наилучшего соответствия Показано также, и R2 из 0,996.
Рисунок 4. LdcI результатов анализа. Участок уровень активности LdcI (в нмоль кадаверин производится мин-1 мкг-1 LdcI) показано в присутствии 100 мкМ ГТФ, ВВП, pppGpp, ppGpp и в отсутствие нуклеотида. Строгие нуклеотидов ответа (р) ppGpp способны существенно подавляя активность LdcI. Погрешности представляют стандартное отклонение по крайней мере шесть независимых измерений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В лизина анализа декарбоксилазы, TNBS реагирует с первичными аминами из L-лизина и кадаверина сформировать ТНП-лизина и ТНП-кадаверин аддуктов (рис. 1). В связи с наличием группы карбоновой кислоты на ТНП-лизин, этот аддукт остается растворим в воде, а ТНП-кадаверин, не имея группы карбоновой кислоты, способен разбиение на толуол 11. Этот тип анализа может быть использован более широко и на другие виды аминокислот, где потери группы карбоновой кислоты происходит во время реакции. Это происходит во время декарбоксилирование L-орнитин по индуцибельной орнитиндекарбоксилазы SPEF сформировать полиамина путресцин 7 и декарбоксилирование L-аргинина индуцибельной аргинин декарбоксилазы Adia сформировать полиамина agmatine 4.
Анализ LdcI описанные здесь обеспечивает относительно быстрый метод определения активности очищенного белка в пробирке. Основные преимущества этого анализа являются:
я) Использование нескольких повторяет в эксперименте повышает точность каждого измерения;
II) анализ может быть проведен в широком диапазоне буфера условия (различные рН, соль, восстановителя и т.д.) без изменения протокола;
III) анализ может быть модифицирован для измерения в естественных условиях деятельности LdcI путем определения количества кадаверин выводится во время клеточного роста.
Основные ограничения этого анализа являются:
я) чувствительность эксперименты ограничены линейного спектра поглощения ТНП-аддуктов;
II) несколько этапов обработки увеличение величины погрешности эксперимента;
III) Не все аминокислот декарбоксилазы кислоты поддаются такой тип протокола. Например, декарбоксилирование L-глутаминовой кислоты индуцибельной глутаминовой кислоты декарбоксилазы Гада / GadB генерирует γ-амино-масляной кислоты 2, TNBS-аддукт, который будет растворим в воде из-за наличия боковой цепи карбоновой кислоты группу.
Биохимические исследования ответ кислоты стресс Е. палочка является расширение области исследований и позволит нам лучше понять молекулярные основы стрессовую реакцию в E. палочки и связанных с ними γ-протеобактерий, которые имеют аналогичную кислоты стрессовую реакцию системы, такие как сальмонелла enterica серовар Typhimurium 12 и вибрион холеры 13. Открытие, что LdcI деятельность тормозится строгие ppGpp регулятора ответ дал нам ранее неизвестных понимание регулирования этого белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Д-р Майкл Кашел (Национальный институт здоровья, Бетезда, штат Массачусетс, США) за отправку бактериальные штаммы, плазмиды, и необходимые протоколы. Мы благодарим д-р Джон Гловер (кафедра биохимии, Университет Торонто) для использования читателя пластины SpecraMax. Великобритания является лауреатом Национальной наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC) последипломного стипендии канадского института стратегических исследований в области здравоохранения учебной программы в структурной биологии мембранных белков Связанный с болезнями, а также Университета Торонто стипендий Open. Эта работа была поддержана грантом от Канадского института исследований в области здравоохранения (СС-67210), чтобы WAH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid | Sigma-Aldrich | P2297 | |
| 0.1 mM pyridoxal 5’-phosphate (PLP) | Sigma-Aldrich | P9255 | |
| Cadaverine | Sigma-Aldrich | D22606 | |
| 96 well polystyrene plates | Sarstedt Ltd | ||
| 96-well quartz plate | Hellma | ||
| VWR Digital Heatblock | VWR international | ||
| ThermoStat Plus | Eppendorf | ||
| 2.0 mL 96-well polypropylene plates | Axygen Scientific | P-DW-20-C | |
| Handy Step Repeat Pipettor | Brand GmbH | ||
| 12.5 mL Repeat Pipettor Tips | Brand GmbH | 702378 | |
| SpectraMax 340PC Plate Reader | SpectraMax |
References
- Gale, E. F., Epps, H. M. The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced. Biochem J. 36, 600-618 (1942).
- Foster, J. W. Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile. Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).
- Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. Control of acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).
- Iyer, R., Williams, C., Miller, C. Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).
- Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochemistry. 13, 662-670 (1974).
- Snider, J. Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase. J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).
- Kashiwagi, K. Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).
- Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. The manifold of vitamin B6 dependent enzymes. Structure. 8, 1-6 (2000).
- Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D. Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. Curtiss, R., Neidhardt, F. C. , ASM Press. Washington, D.C. 1458-1496 (1996).
- Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. ppGpp: a global regulator in Escherichia coli. Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).
- Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase. Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).
- Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium. Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).
- Merrell, D. S., Camilli, A. The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance. Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).
- Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l, Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase. EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).
