测定在异种细胞表面的化学感应受体的表达
Summary
在这里，我们展示了一个协议，进行活细胞染色，可用于检测HEK293T细胞表面上的气味受体方便。此外，它也可能被用来检测其他化学感受受体或GPCRs的表面表达。
Abstract
是公认的嗅觉感的生动的气味世界。在小鼠的嗅觉是介导的由约1200克蛋白偶联受体（GPCRs）1，假设绑定挥发的气味分子，并通过与G蛋白耦合Gαolf的胞内信号转换成细胞外信号的剧目。绑定的气味受体被认为是按照组合规则，也就是说，一个气味可能几个受体绑定和一个受体可以绑定几个气味不同程度2。生化，信令和配体结合研究已方便进行最GPCRs的使用异种细胞。但是使用的气味受体的研究，异种细胞，排除了很长一段时间，因为他们在转没有出口到表面。 Saito等人已经证明单膜通过受体运输蛋白（RTP）的家庭伴侣显示在嗅感觉神经元和交通气味受体在异种细胞的表面，当联合一起转了3伴侣的行为表达增强。要利用异种细胞的受体进行生化检测，必须先确定，如果受体的细胞株显示了强大的表面表达。这可以检测高表达的受体与由活细胞染色，荧光标签或专门的外域外域标记的伴侣RTP1S。在这里，我们展示了一个协议，进行活细胞染色，可用于检测HEK293T细胞表面上的气味受体方便。此外，它也可能被用来检测其他化学感受受体或GPCRs的表面表达。
Protocol
Discussion
每一步都必须小心进行，以确保突出和独特的表面染色。整个染色过程中，必须在寒冷的开展（冰），和盖玻片奠定托盘必须被冷却之前使用，以确保细胞活路。此外，固定做表面染色过程结束。这是内部染色，其中固定先染色通透细胞膜的小学和中学抗体形成鲜明对比的。盖玻片暴露在空气中的时间必须最小化，以防止从干涸的细胞，因此盖玻片与抗体的解决方案的分层，转让盖玻片洗涤液，?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢阅读这篇稿子的关键松波实验室的成员。
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Scientific | 72200-11 | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000 | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
| Minimal essential medium | Sigma | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | ||
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | Gibco | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium | |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280 | ||
| Sodium Azide | EM Science | SX0299-1 | ||
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon | 353801 | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
