Organotypische hippocampus Slice culturen
Summary
We beschrijven een methode om organotypische hippocampale slices die gemakkelijk kan worden aangepast aan andere hersengebieden te bereiden. Brain plakjes worden gelegd op poreuze membranen en cultuur media is toegestaan om een interface te vormen. Deze methode behoudt de bruto-architectuur van de hippocampus voor maximaal 2 weken in cultuur.
Abstract
De hippocampus, een onderdeel van het limbisch systeem, speelt een belangrijke rol in het lange termijn geheugen en ruimtelijke navigatie 1. Hippocampale neuronen kunt de kracht van hun verbindingen na korte periodes van sterke activering. Dit fenomeen, bekend als de lange termijn potentiatie (LTP) kan duren voor uren of dagen en is uitgegroeid tot de beste kandidaat mechanisme voor leren en geheugen 2. Daarnaast is het goed gedefinieerde anatomie en de connectiviteit van de hippocampus drie maakten het tot een klassiek model systeem om synaptische transmissie en synaptische plasticiteit 4 te bestuderen.
Als ons begrip van de fysiologie van de hippocampus synapsen groeide en moleculaire spelers werd geïdentificeerd, een behoefte om synaptische proteïnen te manipuleren werd noodzakelijk. Organotypische hippocampus culturen bieden de mogelijkheid voor een eenvoudige genetische manipulatie en precies farmacologische interventie, maar behouden synaptische organisatie die is van cruciaal belang voor het begrijpen van synaps functioneren in een meer naturalistische context dan routine cultuur gedissocieerd neuronen methoden.
Hier presenteren wij een methode voor te bereiden en cultuur hippocampale slices die gemakkelijk kunnen worden aangepast aan andere hersengebieden. Deze methode maakt een eenvoudige toegang tot de plakjes voor genetische manipulatie met behulp van verschillende methoden zoals virale infectie 5,6 of biolistics 7. Daarnaast kunnen plakken eenvoudig worden teruggewonnen voor biochemische assays 8, of overgedragen aan microscopen voor beeldvorming 9 of elektrofysiologische experimenten 10.
Protocol
Discussion
Deze methode is gebaseerd op de methode eerst beschreven door Stoppini et al.. Elf en biedt een snelle manier om de cultuur hippocampale slices. Het belangrijkste aspect van dit protocol is het handhaven van plakjes steriel, daarom is het van cruciaal belang voor geschikte steriele technieken te gebruiken en goed te desinfecteren en steriliseren van al het materiaal in contact met het weefsel.
Verschillende serums bronnen kunnen invloed hebben op de kwaliteit van de schij…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door NINDS – NIH R01NS060756
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | ||
| 6 well plates | BD Falcon | 353046 | ||
| Tissue Slicer | Stoelting | 51425/51415 | ||
| Microscope | Olympus | SZX7-ILLD2-100 | ||
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T | 10099-15 | ||
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | ||
| Iris Spatula | F.S.T | 10093-13 | ||
| Straight spatula | F.S.T | 10094-13 | ||
| Rounded spoon micro spatula | VWR | 57949-039 | ||
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Science | 72946 | ||
| Dissecting tweezers | Dummont | #2 | ||
| Small dissecting scissors | F.S.T | 14060-10 | ||
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | ||
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | ||
| CaCl2 (1 M) | Sigma | C3881 | ||
| MgSO4 (1 M) | Sigma | M2773 | ||
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma | I0516 | ||
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma | A4544 | ||
| D-Glucose | Sigma | G5767 | ||
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ||
| Hepes | Sigma | H7523 | ||
| Sucrose | Sigma | S5016 | ||
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma | P0290 | ||
| KCl | Sigma | P3911 | ||
| MgCl2 (1 M) | Sigma | M9272 |
References
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. n. t. r. o. d. u. c. t. i. o. n. Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
- Shepherd, G. M. . The synaptic organization of the brain. , (2004).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
- Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
- Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Simoni, A. D. e., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
