Органотипической гиппокампа культур фрагмент
Summary
Мы опишем способ получения органотипической срезах гиппокампа, которые могут быть легко адаптированы для других областей мозга. Мозг ломтики укладываются на пористые мембраны и культура СМИ позволили сформировать интерфейс. Этот метод сохраняет валового архитектуры гиппокампа на срок до 2-х недель в культуре.
Abstract
Гиппокампе, компонент лимбической системы, играет важную роль в долговременной памяти и пространственной навигации 1. Нейронов гиппокампа может изменять силу своих связей после коротких периодов сильной активации. Это явление, известное как долгосрочные потенцирования (LTP) может длиться в течение нескольких часов или дней и стал лучшим кандидатом механизм обучения и памяти 2. Кроме того, четко определены анатомии и связи гиппокампа 3 сделал классической модельной системой для изучения синаптической передачи и синаптической пластичности 4.
Как наше понимание физиологии гиппокампа синапсов вырос и молекулярных игроков стал отождествляться, должны манипулировать синаптические белки стало императивом. Органотипической гиппокампа культур дают возможность для облегчения работы генов и точное фармакологического вмешательства, но сохранить синаптических организация, которая имеет решающее значение для понимания синапсов функционировать в более натуралистическом контексте, чем обычный культуре диссоциированных методы нейронов.
Здесь мы представляем метод для подготовки и культуры срезах гиппокампа, которые могут быть легко адаптированы для других областей мозга. Этот метод позволяет легко добраться до срезы для генетических манипуляций, используя различные подходы, такие как вирусная инфекция или 5,6 biolistics 7. Кроме того, ломтики может быть легко восстановлено для биохимических анализов 8, или переведены на микроскопы для работы с изображениями 9 или электрофизиологических экспериментов 10.
Protocol
Discussion
Этот метод основан на методе, впервые описанный Stoppini и соавт. 11 и предлагает быстрый способ к культуре срезах гиппокампа. Наиболее важным аспектом этого протокола заключается в поддержании ломтиками стерильной, поэтому очень важно использовать соответствующие методы и сте?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась NINDS – NIH R01NS060756
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | ||
| 6 well plates | BD Falcon | 353046 | ||
| Tissue Slicer | Stoelting | 51425/51415 | ||
| Microscope | Olympus | SZX7-ILLD2-100 | ||
| Hippocampus dissecting tool | F.S.T | 10099-15 | ||
| Large utility scissors. Perfection | F.S.T | 37500-00/37000-00 Right/ Left handed | ||
| Iris Spatula | F.S.T | 10093-13 | ||
| Straight spatula | F.S.T | 10094-13 | ||
| Rounded spoon micro spatula | VWR | 57949-039 | ||
| Dissecting single cutting edge needle | Electron Microscopy Science | 72946 | ||
| Dissecting tweezers | Dummont | #2 | ||
| Small dissecting scissors | F.S.T | 14060-10 | ||
| MEM Eagle medium | Cellgro | 50-019 PB | ||
| Horse serum heat inactivated | Invitrogen | 26050-88 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030081 | ||
| CaCl2 (1 M) | Sigma | C3881 | ||
| MgSO4 (1 M) | Sigma | M2773 | ||
| Insulin (1 mg/ml), dissolved in HCl 0.01 N | Sigma | I0516 | ||
| Ascorbic Acid, solution (25%) | Sigma | A4544 | ||
| D-Glucose | Sigma | G5767 | ||
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ||
| Hepes | Sigma | H7523 | ||
| Sucrose | Sigma | S5016 | ||
| Phenol Red Solution 0.5% in DPBS | Sigma | P0290 | ||
| KCl | Sigma | P3911 | ||
| MgCl2 (1 M) | Sigma | M9272 |
References
- Martin, S. J., Grimwood, P. D., Morris, R. G. Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis. Annu Rev Neurosci. 23, 649-711 (2000).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. I. n. t. r. o. d. u. c. t. i. o. n. Long-term potentiation and structure of the issue. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358, 607-611 (2003).
- Shepherd, G. M. . The synaptic organization of the brain. , (2004).
- Malinow, R., Tsien, R. W. Presynaptic enhancement shown by whole-cell recordings of long-term potentiation in hippocampal slices. Nature. 346, 177-180 (1990).
- Malinow, R. Introduction of green fluorescent protein (GFP) into hippocampal neurons through viral infection. Cold Spring Harb Protoc. , (2010).
- Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105, 331-343 (2001).
- Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J Vis Exp. , (2008).
- Esteban, J. A. PKA phosphorylation of AMPA receptor subunits controls synaptic trafficking underlying plasticity. Nat Neurosci. 6, 136-143 (2003).
- Mainen, Z. F. Two-photon imaging in living brain slices. Methods. 18, 231-239 (1999).
- Barria, A., Malinow, R. Subunit-specific NMDA receptor trafficking to synapses. Neuron. 35, 345-353 (2002).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
- Simoni, A. D. e., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. J Physiol. 550, 135-147 (2003).
