Summary
Un método para la incorporación de colonias de levadura que permite el corte de luz y microscopía electrónica. Este protocolo permite la determinación de la distribución de células y las células esporuladas pseudohyphal dentro de las colonias de proporcionar una nueva herramienta en la comprensión de la organización de los tipos de células dentro de una comunidad de hongos.
Abstract
Patrón de los diferentes tipos de células en embriones es un mecanismo clave en el desarrollo de los metazoos. Comunidades de microorganismos, tales como colonias y biofilms también muestran patrones de tipos de células. Por ejemplo, en el de levadura de S. cerevisiae, células y las células esporuladas pseudohyphal no están distribuidas uniformemente en las colonias. La importancia funcional de los patrones y los mecanismos moleculares que subyacen a estos modelos son aún poco conocidos.
Uno de los retos con respecto a la investigación de patrones de tipos de células en las colonias de hongos es que a diferencia del tejido metazoos, las células en las colonias son relativamente débilmente unidas entre sí. En particular, las colonias de hongos no contienen el mismo nivel amplio de la matriz extracelular en la mayoría de los tejidos. Aquí nos informe sobre un método para la inclusión y corte de colonias de levaduras que revela los patrones interior de tipos de células en estas colonias. El método puede ser usado para preparar secciones gruesas (0,5 μ) es útil para microscopía óptica y secciones delgadas (0,1 μ) adecuada para la microscopía electrónica de transmisión. Células ascos y pseudohyphal se pueden distinguir fácilmente de las células de levadura ovoide por microscopía de luz, mientras que la estructura interior de estas células puede ser visualizado por EM.
El método se basa en los alrededores de las colonias con agar, infiltrándose en ellos con el medio de Spurr, y luego el corte. Las colonias con un diámetro en el rango de 1-2 mm son adecuados para este protocolo. Además de visualizar el interior de las colonias, el método permite la visualización de la región de la colonia que invade el agar subyacente.
Protocol
1. Colonia El aislamiento y la fijación
- Incubar 300 colonias en un medio de agar durante el tiempo indicado (una colonia aislada debe ser de 1-2 mm de diámetro).
- Retire la colonia (boca arriba) y medio subyacente utilizando una espátula.
- Coloque varias gotas de 2% de agar 42 ° C en un portaobjetos con 1 mL Pipetman punta y de inmediato el lugar de colonias en el rostro de agar antes de que se solidifica.
- Coloque varias gotas de 2% de agar 42 ° C en la colonia y dejar que se solidifique.
- Use guantes para todos los pasos en lo que resta de este protocolo
- Bloque de corte con cuchilla de afeitar y colocarlos en un 3,5 ml de borosilicato con tapón de rosca vial que contiene 2% de paraformaldehído / 2% fijador de glutaraldehído durante 7 días a 4 ° C.
2. Se lava y tratamiento de osmio
- Después de aproximadamente una semana, lavado de bloques de agar en el hielo bajo campana para sustancias químicas mediante la incubación de dos veces durante 15 minutos con cacodilato de sodio 0,15 M suficiente (pH 7,2) para cubrir por completo la colonia (aproximadamente 1,5 ml) y luego dos veces más durante 5 minutos con el mismo volumen 1X buffer de SO (100 mM KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6,0).
- Añadir el mismo volumen de 1% de OsO 4 [2 ml OsO 4 (2%) + 2 ml de 2x OS Buffer] para viales (en hielo) para cubrir los bloques de agar en campana para sustancias químicas de 1 hora y luego lavar dos veces con la misma cantidad 1X buffer de SO durante 10 minutos cada uno.
- Deja viales durante la noche a 4 ° C en 1X buffer del sistema operativo.
- Fijador y todos los lavados en este paso se eliminan como residuos peligrosos. Todas las pipetas contienen OsO4 se lavaron 3X con aceite vegetal.
3. Lavado y deshidratación
- A la mañana siguiente bloques de agar lavado dos veces en el hielo con el mismo volumen que el anterior de agua fría durante 10 minutos cada uno con una pipeta Pasteur.
- Lavar sucesivamente con el mismo volumen de 25%, 50%, 75%, 95% de etanol durante 10 minutos cada uno seguido por dos lavados con etanol al 100% durante 10 minutos. Dejar toda la noche a 4 ° C en el 100% de etanol.
- Todos los lavados en este paso se eliminan como residuos peligrosos.
4. Preparación de Spurr
- A la mañana siguiente (lo más temprano posible) pesan las siguientes soluciones (Ciencias de la EM) en un vaso de plástico desechable en una campana de extracción para preparar reactivos de Spurr. Para todos los trabajos posteriores de este método, siga utilizando una campana de humos.
(ERL 4221 solución de 5 gramos)
(DER 736 solución de 4 gramos)
(Solución NSA 13 gramos) - mezcla de estas soluciones (lentamente) durante 20 minutos en campana es suficiente utilizar una barra de agitación
- Añadir la solución de DMAE 0,15 gramos y revuelva 20 minutos anteriores.
- Degas por encima de la mezcla durante 1-2 horas en la campana.
5. La infiltración de Spurr
- Tan pronto como Spurr se lave bloques de agar 5 veces con un volumen igual al anterior de 100% de etanol temperatura ambiente durante 10 minutos cada uno. Después del lavado de etanol última separar el etanol con una pipeta Pasteur para que el etanol restante apenas cubre los bloques de agar.
- Añadir aproximadamente la misma cantidad de reactivo de Spurr (aproximadamente 0,5 ml) y girar viales en la rueda durante 15 minutos a temperatura ambiente y se deja reposar durante 30 minutos. Después de 30 minutos, retire la solución completa con una pipeta Pasteur, añadir Spurr de cubierta del bloque de agar (aproximadamente 1,5 ml), gire viales en la rueda durante 15 minutos a temperatura ambiente y dejar reposar durante 30 minutos. Repita el reemplazo de Spurr, rotación, y la incubación de 3 veces más.
- Después de los últimos 30 minutos, retire los reactivos de Spurr y añadir nuevas Spurr para cubrir los bloques. Permita que los bloques de agar para estar a temperatura ambiente durante 4 horas.
- Vuelva a colocar la de Spurr y rotar durante la noche.
- En la mañana reemplazar Spurr y dejar girando hasta el día siguiente.
- El Spurr mañana siguiente lugar en moldes de silicona numeradas (Fisher Scientific) sólo para cubrir el fondo de los moldes a continuación, añadir bloques de agar a los moldes. Se incuba a 60 ° C durante 4 horas
- Después de 4 horas, parte superior de los moldes, con los más Spurr y se incuba a 60 ° C durante la noche.
- Si después de retirar los bloques de los moldes de los bloques son todavía un poco flexibles, volver a los moldes y se incuba un adicional de 2 días
6. Seccionamiento
- Un microtomo Ultracut Leica S fue utilizado para cortar secciones de 0,5 μ de espesor para microscopía de luz y 0,1 μ secciones delgadas de EM de transmisión.
- Para microscopía de luz, ya que se cortaron secciones, que fueron colocados en una gota de dH 2 O, y se seca en un 52 ° C del bloque de calor. Secciones de secado fueron teñidas con una caída de 1,0% de azul de toluidina, el 1% borato de sodio de 5.15 segundos. Después de la tinción, las secciones se lavaron inmediatamente bajo un chorro de agua, se seca, cubierta en medio de montaje (KPL) y una hoja de cubierta sellada en la muestra.
La amplia relevancia de la medición de la formación de patrones en la levadura y otros microorganismos han sido revisados previamente 1. De particular interés es el aumento de la funcionalidad de las colonias microbianas organizadas en relación con las comunidades desorganizadas.
El método descrito es una modificación de un método para la incorporación de grandes colonias especializados 2, y una breve descripción de nuestras modificaciones se han publicado 3.
Un ejemplo de una micrografía de luz de una sección a través del centro de una colonia salvaje de S. colonia de levadura Saccharomyces se muestra en la Figura 1. Ascos, pseudohifas y levaduras ovoides son fácilmente distinguibles, y en la región de la colonia invadir el agar subyacente es también evidente.
Un ejemplo de una micrografía electrónica de una cepa de laboratorio de la levadura (W303 de fondo) se muestra en la Figura 2. La imagen es de una región de la colonia que contiene una alta frecuencia de células esporuladas.
Figura 1. Microscopía de luz de una colonia de hongos silvestres. Esta levadura (YPS133) fue aislada recientemente de 4 exudados de árboles. La colonia se incubó durante 6 días en medio de YNA 5 antes de cortar. Flechas abiertas indican representante ascos, lleno de flechas indican las células vegetativas representante ovoide, puntas de flecha indican lleno de cadenas de células alargadas (pseudohifas) y ascos.
Figura 2. Microscopia electrónica de una cepa de levadura de laboratorio. La colonia de SH1020 (W303 de fondo) se incubó durante 6 días en el medio YNA antes de seccionar 3. La imagen muestra una región de la sección con una alta frecuencia de ascos. Una flecha indica la estructura de dos capas de la pared de la espora.
Figura 3. La cuantificación de la distribución de células esporuladas en las colonias de: A) una cuadrícula que contiene 15 rectángulos contiguos apilados a lo largo de su lado más largo se superpone a la región central de la imagen de una sección de la colonia. La red es reducido, manteniendo sus proporciones constantes, que sólo cubre la parte superior e inferior de la colonia. (B & C) La fracción de células esporuladas en cada rectángulo en relación con el total de células en el rectángulo que se determina por inspección visual de las imágenes de los viejos de 4 días (B) y 8 días de las antiguas colonias (C). Por ejemplo, el rectángulo en la parte superior de la colonia ("1") corresponde a la parte izquierda de la gráfica. La media de cuatro colonias se muestra, las barras de error de visualización de la std. error.
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Discussion
El método presentado revela las estructuras interiores de las colonias. Debido a que el método es eficaz en la determinación de patrones de tipos de células en una variedad de S. cerevisiae con morfologías diferentes colonias, y también en una especie relacionada S. paradoxus 5, el método también es probable que trabajar en una amplia gama de hongos y otros microorganismos.
Un paso fundamental para el éxito del método es asegurar que toda la colonia, incluyendo la parte superior de la colonia, está encerrado en agar durante todo el protocolo. Si las colonias están completamente encerrados en el agar se puede determinar después de la sección para microscopía óptica y tinción con azul de toluidina. Cuando las secciones teñidas son vistos por microscopía de luz, el medio de agar se tiñe un poco más oscuro que el medio de inclusión. Debido a que se contrae agar durante las etapas de deshidrataciones, a fin de recuperar toda la colonia, asegúrese de: 1) agregar 4-5 gotas de agar para cubrir de forma fiable la colonia en el paso 1.2, y 2) recortar el agar sólo en los lados, no en la parte superior e inferior, y sólo recortar lo suficiente para que pueda caber dentro de los moldes en el paso 1.5.
Una segunda fase del protocolo que es crítico para las secciones óptimo consiste en la dureza del bloque de medio de inclusión. Normalmente, los bloques son examinados después de la incubación durante la noche, eliminándolos de los moldes. Si los bloques están siendo flexibles cuando se mantiene entre las dos manos y flexiona, probablemente no son lo suficientemente duro para el corte. En este caso, se devuelven a la incubadora a la misma temperatura durante 48 horas adicionales y vuelto a probar que el anterior.
La importancia de ser capaz de detectar patrones de tipos de células dentro de las colonias microbianas es que estos patrones de probabilidad de tener una organización funcional de las células en las comunidades. De hecho, los patrones microbianos pueden reflejar mecanismos antiguos y fundamentales por los cuales los organismos de la misma especie interactuar. Junto con los métodos de seguimiento de las pautas de la expresión génica en las colonias de 3,6, la capacidad de detectar los patrones de diferenciación de las células de estas comunidades pueden ayudar a probar los posibles mecanismos de formación de microorganismos modelo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
La investigación fue financiada por el NIH 1R15GM094770.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
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