تدفق تنقية الخلوي للخلايا الفأر الانتصافي
Summary
وصفت وسيلة فعالة للحصول على تخصيبه بدرجة الكسور الانتصافي قابلة للحياة من خصية الفأر ، الذي يجمع بين المكرر الخلية تفارق بروتوكول مع الفلورسنت الفرز تنشيط الخلية (FACS). هذا الأسلوب تستفيد من الاختلافات في المحتوى وكثافة النووية DNA الكسور الانتصافي منفصلة.
Abstract
كانت الطبيعة غير المتجانسة من أنواع الخلايا في الخصية وعدم وجود نماذج الانتصافي خلية ثقافة عقبات كبيرة لدراسة البرامج التمايز الفريدة التي تظهر خلال الانقسام الاختزالي. وقد وضعت اثنين من الطرق الرئيسية لتنقية ، بدرجات متفاوتة ، وكسور مختلفة من كلا الانتصافي الكبار والحيوانات غير ناضجة : تصويل أو Staput (الترسيب) باستخدام جيش صرب البوسنة و / أو تدرجات percoll. كل من هذه الأساليب تعتمد على حجم الخلية وكثافة لفصل الخلايا الانتصافي 1-5. عموما ، باستثناء عدد قليل من السكان الخلية 6 ، هذه البروتوكولات لا تسفر نقاء كافية للسكان الخلية الانتصافي العديدة والتي هي ضرورية لإجراء تحليلات مفصلة الجزيئية. وعلاوة على ذلك ، يمكن مع مثل هذه الأساليب يمكن تنقيته عادة نوع واحد من الخلايا الانتصافي في وقت معين ، والذي يضيف مستوى إضافي من التعقيد فيما يتعلق استنساخ والتجانس عند مقارنة عينات الخلايا الانتصافي.
هنا ، نحن تصف طريقة المكرر الذي يسمح للمرء أن يتخيل بسهولة ، وتحديد ، وتنقية الخلايا الانتصافي من الخلايا الجرثومية الى أرومة النطفة في الجولة ، وذلك باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية جنبا إلى جنب مع تلوين 33342 هويشت 7،8. هذا الأسلوب يوفر لقطة الكلي للعملية برمتها الانتصافي ويسمح احد لتنقية عالية خلايا قابلة للحياة من معظم مرحلة الانقسام الاختزالي. ويمكن بعد ذلك تنقية هذه الخلايا يتم تحليلها بالتفصيل عن التغييرات التي تصاحب التقدم الجزيئية من خلال الانقسام الاختزالي ، على سبيل المثال التغيرات في التعبير الجيني 9،10 وديناميات الإشغال في المناطق الساخنة من النيوكليوسومات تأشب الانتصافي 11.
Protocol
Discussion
البروتوكول المقدمة في هذه الوثيقة يسمح احد لتنقية واحد من الفئران الذكور البالغين مجموعة كاملة من الخلايا مرحلة الانتصافي مع درجة نقاوة عالية جدا ، مما يسمح للمحققين لدراسة ديناميات هذه العملية الأساسية. ويمكن استخدام الخلايا النقية للعديد من التطبيقات بدءا من است…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أيد هذا المشروع في جزء من الأموال من ولاية فلوريدا لسكريبس وأرقام وR21HD061304 R01GM085079 جائزة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة والمعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية ، على التوالي. هذا هو الرقم 20917 مخطوطة من معهد سكريبس للأبحاث.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Collagenase Type-1 | Worthington | CLSS1 | Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C | |
| Trypsin | Worthington | TRL3 | Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C | |
| Hoechst 33342 | Arcos | 230001000 | Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DNEP | Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C | |
| Gey’s Balance Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | ||
| 6″ Transfer Pipet | Fisher Scientific | 137119D |
References
- Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
- Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity. J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).
- Purification, A. R. culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).
- Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization. Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).
- Meistrich, M. L., Trostle, P. K. Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients. Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).
- Namekawa, S. H. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).
- Lassalle, B. Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131, 479-487 (2004).
- Bastos, H. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65, 40-49 (2005).
- Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. Genetic analysis of variation in human meiotic recombination. PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).
- Roig, I. Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis. PLoS Genet. 6, (2010).
- Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots. EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).
- Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis. Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).
