Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

Summary

Een efficiënte methode om in hoge mate gezuiverd levensvatbare meiotische fracties te verkrijgen van de muis testis wordt beschreven, die een combinatie van een verfijnde cel dissociatie protocol met TL-geactiveerde cel sortering (FACS). Deze methode maakt gebruik van verschillen in het DNA-gehalte en de nucleaire dichtheid van discrete meiotische fracties.

Abstract

Het heterogene karakter van de celtypen in de testis en de afwezigheid van meiotische celkweek modellen zijn belangrijke obstakels voor de studie van de unieke differentiatie programma's die zich manifesteren zijn tijdens de meiose. Twee belangrijkste methoden zijn ontwikkeld om, te zuiveren in verschillende mate, diverse meiotische fracties uit zowel volwassen en onvolwassen dieren: elutriatie of Staput (sedimentatie) met behulp van BSA en / of Percoll gradiënten. Beide van deze methoden afhankelijk van celgrootte en dichtheid te scheiden cellen in de meiose ^1-5. Het algemeen, behalve voor enkele celpopulaties ^6, deze protocollen onvoldoende zuiverheid van de talrijke meiotische celpopulaties die nodig zijn voor gedetailleerde moleculaire analyses opleveren. Bovendien, met dergelijke methoden meestal een soort van cellen in de meiose kan worden gezuiverd op een gegeven tijd, die een extra niveau van complexiteit ten aanzien van de reproduceerbaarheid en de homogeniteit bij het vergelijken van de meiose celmonsters toevoegt.

We beschrijven hier een verfijnde methode die het mogelijk maakt een gemakkelijk te visualiseren, te identificeren en meiotische cellen te zuiveren, van kiemcellen te ronden spermatiden, met behulp van FACS in combinatie met Hoechst 33342 vlekken ^7,8. Deze methode biedt een algemeen overzicht van het gehele meiotische proces en maakt het mogelijk om zeer zuiveren levensvatbare cellen van de meeste fase van de meiose. Deze gezuiverde cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in detail voor de moleculaire veranderingen die progressie te begeleiden door middel van meiose, bijvoorbeeld veranderingen in genexpressie ^9,10 en de dynamiek van nucleosoom bezetting bij hotspots van meiotische recombinatie ^11.

Protocol

Dit protocol kan worden gescheiden in twee grote stappen: (1) de dissociatie en Hoechst 33342 kleuring van de muis testis cellen gevolgd door, indien nodig, (2) FACS-sortering van de relevante meiotische fracties, met inbegrip van alle stadia van de meiose, uit kiemcellen tot ronde spermatiden. Eenmaal verzameld, kunnen deze hoogverrijkt meiotische bevolkingsgroepen worden gebruikt voor een breed scala aan analyse. Dit protocol beschrijft de dissociatie van een volwassen testis; volumes kunnen worden aangepast voor jong…

Discussion

Het protocol vermeld in dit document maakt het mogelijk om tegelijk te zuiveren van volwassen mannelijke muizen het hele bereik van de meiotische podium cellen met een zeer hoge zuiverheid, waardoor onderzoekers de dynamiek studie van deze fundamentele proces. Gezuiverde cellen kunnen worden gebruikt voor tal van toepassingen, variërend van RNA-extractie ^9,10, nucleosoom in kaart brengen van ^11, recombinant molecuul detectie, eiwit analyses, en nog veel meer. Echter, detectiemethoden moeten worden…

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Collagenase Type-1		Worthington	CLSS1	Dissolve to 12,000U/ml in GBSS, store at 4°C
Trypsin		Worthington	TRL3	Dissolve in 1mM HCl to 50mg/ml, store at 4°C
Hoechst 33342		Arcos	230001000	Saturated solution (10mg/ml in DMSO, store at 4°C
DNAse I		Sigma-Aldrich	DNEP	Dissolve in water/50% glycerol to 1mg/ml, store at -20°C
Gey’s Balance Salt Solution		Sigma-Aldrich	G9779
6″ Transfer Pipet		Fisher Scientific	137119D