Chromatin Immunopräzipitation-Assay für Tissue-spezifische Gene mit Frühzeitige muriner Embryonen
Summary
Wir zeigen eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Methode, um Wechselwirkungen zwischen Faktoren bei Gewebe-spezifische Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Gen-Expression in embryonalen Maus-Gewebe zu identifizieren. Dieses Protokoll sollte allgemein anwendbar für die Untersuchung von Gewebe-spezifische Genaktivierung, wie es während der normalen Embryonalentwicklung auftritt.
Abstract
Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um Protein zu identifizieren: Chromatin-Wechselwirkungen, die im Kontext von lebenden Zellen 1-3 auftreten. Diese Technik wurde in großem Umfang in Gewebekulturzellen ausgebeutet und in geringerem Maße, in primärem Gewebe. Die Anwendung des ChIP mit Nagetier-embryonalen Gewebe, insbesondere in den frühen Zeiten der Entwicklung ist durch die begrenzte Menge an Gewebe und die Heterogenität der Zell-und Gewebetypen des Embryos kompliziert. Hier präsentieren wir eine Methode, um ChIP durchführen mit einem dissoziierten Embryonaltag 8,5 (E8.5) Embryo. Geschert Chromatin aus einem einzigen Embryo E8.5 können unterteilt werden in bis zu fünf Portionen, die die Ermittler genügend Material ermöglicht Kontrollen und für die Untersuchung von spezifischen Protein: Chromatin-Wechselwirkungen.
Wir haben diese Technik genutzt, um zu beginnen, um Protein-Dokument: Chromatin-Wechselwirkungen bei der Spezifikation von Gewebe-spezifischen Genexpression Programme. Die Heterogenität der Zelltypen im Embryo notwendig schränkt die Anwendung dieser Technik, weil das Ergebnis ist der Nachweis von Protein: Chromatin-Wechselwirkungen ohne Unterscheidung, ob die Wechselwirkungen treten in allen, eine Teilmenge von oder einem Zelltyp (s). Allerdings ist die Untersuchung von Gewebe-spezifischer Gene während oder nach dem Einsetzen der Gewebe-spezifische Genexpression möglich aus zwei Gründen. Zunächst Immunpräzipitation von gewebespezifischen Faktoren nicht unbedingt isoliert Chromatin aus dem Zelltyp, wo der Faktor ausgedrückt. Zweitens sollte Immunpräzipitation von Ko-Aktivatoren und Histonen mit post-translationale Modifikationen, die mit Gen-Aktivierung assoziiert sind nur bei Genen und Genprodukten regulatorische Sequenzen in die Zelle Typ, bei dem das Gen wird gefunden werden oder wurde aktiviert. Die Technik sollte für das Studium der meisten Gewebe-spezifische Genaktivierung Veranstaltungen.
Im Beispiel unten beschrieben, verwendeten wir E8.5 und E9.5 Maus-Embryonen zu Faktor Bindung an ein Skelettmuskel spezifischen Gen-Promotor zu untersuchen. Somiten, die eine Vorstufe Gewebe, aus denen die Skelettmuskeln des Rumpfes und der Gliedmaßen bilden, sind an E8.5-9.5 4,5 präsentieren. Myogenin ist ein regulierender Faktor für die Skelettmuskulatur Differenzierung 6-9 erforderlich. Die Daten zeigen, dass Myogenin mit seinen eigenen Promotor in E8.5 und E9.5 Embryonen verbunden ist. Da Myogenin ist nur in Somiten in diesem Stadium der Entwicklung 6,10 ausgedrückt, zeigen die Daten, die Myogenin Interaktionen mit ihren eigenen Promotor haben bereits in der Skelettmuskulatur Vorläuferzellen in E8.5 Embryonen aufgetreten.
Protocol
Discussion
In der beschriebenen ChIP-Protokoll zeigen wir, dass die myogene Regler Myogenin mit dem Myogenin Promotor in der Skelettmuskulatur Vorläuferzellen Gewebe in einzelne E8.5 und E9.5 Embryonen verbunden ist. Frühere Studien haben ausführlich Myogenin Bindung an E-Box enthält Sequenzen aus, beginnend mit dem ersten in vitro Gel-Shift-Experimente unter Verwendung in vitro übersetzt oder bakteriell produzierten Myogenin und radioaktiv markierten DNA-Codierung der relevante Teil der Zielgen regulatorisc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH R01 GM56244 zu ANI, die Gelder durch den American Recovery and Reinvestment Act of 2009 ausgezeichnet umfasst, und durch den NIH R01 GM87130 zu Jarp
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
| Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |
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