Ensaio para imunoprecipitação da cromatina Genes Tissue-específicos usando embriões em início de carreira do rato
Summary
Nós demonstramos uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) para identificar as interações fator em tecido-específicos genes durante ou após o início da tecido-específicos de expressão gênica em camundongos tecido embrionário. Este protocolo deve ser amplamente aplicáveis para o estudo do tecido-específicos ativação do gene como ocorre durante o desenvolvimento embrionário normal.
Abstract
Cromatina imunoprecipitação (chip) é uma ferramenta poderosa para identificar proteínas: interações cromatina que ocorrem no contexto de células vivas 1-3. Esta técnica tem sido amplamente explorada em células de cultura de tecidos, e, em menor grau, no tecido primário. A aplicação do chip para o tecido embrionário de roedores, sobretudo em momentos iniciais de desenvolvimento, é complicado pela quantidade limitada de tecido e da heterogeneidade das células e tecidos no embrião. Aqui apresentamos um método para realizar chip usando um dia dissociada embrionárias 8.5 (E8.5) do embrião. Cromatina tosquiada de um embrião E8.5 única pode ser dividido em até cinco alíquotas, que permite que o investigador material suficiente para controles e para a investigação de proteínas específicas: interações cromatina.
Temos utilizado esta técnica para começar a documentar proteína: interações cromatina durante a especificação de tecido programas específicos de expressão gênica. A heterogeneidade de tipos de células em um embrião, necessariamente, restringe a aplicação desta técnica porque o resultado é a detecção de proteínas: interações cromatina sem distinguir se as interações ocorrem em todos, um subconjunto de, ou um único tipo de células (s). No entanto, o exame de tecido específico genes durante ou após o aparecimento de tecido-específicos de expressão gênica é viável por dois motivos. Primeiro, imunoprecipitação de fatores tecido específico necessariamente isola cromatina do tipo de célula onde o fator é expresso. Segundo, imunoprecipitação de coativadores e histonas contendo modificações pós-translacionais que estão associados com a ativação do gene só deve ser encontrada em genes e seqüências regulatórias no tipo de células onde o gene está sendo ou foi ativado. A técnica deve ser aplicado ao estudo da maioria dos tecidos específicos eventos de ativação do gene.
No exemplo descrito abaixo, utilizamos E8.5 e E9.5 embriões de camundongos para analisar fator determinante em um esqueleto promotor do gene do músculo específico. Somitos, que são os tecidos precursor a partir do qual os músculos esqueléticos do tronco e membros formarão, estão presentes em E8.5-9.5 4,5. Miogenina é um fator de regulação necessários para a diferenciação do músculo esquelético 6-9. Os dados demonstram que miogenina está associado ao seu próprio promotor em E8.5 e E9.5 embriões. Porque miogenina é expresso apenas em somitos nesta fase de desenvolvimento 6,10, os dados indicam que as interações com miogenina seu promotor própria já ocorreu em células do músculo esquelético precursor em E8.5 embriões.
Protocol
Discussion
No protocolo ChIP descrito, mostramos que a miogenina regulador miogênico está associada com o promotor miogenina no tecido músculo esquelético precursor presente em E8.5 E9.5 única e embriões. Estudos anteriores extensamente caracterizada miogenina ligação a caixa de E contendo seqüências, começando com a inicial em experimentos in vitro, utilizando gel shift in vitro traduzido ou bactérias produzidas DNA miogenina e radiolabeled codificação a parte relevante de seqüências-alv…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 GM56244 a ANI, que inclui fundos concedidos através da Lei de Recuperação e Reinvestimento de 2009, e pelo NIH R01 GM87130 para JARP
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
| Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |
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