הכרומטין Assay immunoprecipitation עבור גנים ספציפיים רקמות באמצעות שלבים מוקדמים של עוברי עכברים
Summary
אנו מדגימים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) שיטה לזהות אינטראקציות גורם ספציפי על רקמות גנים במהלך או לאחר הופעת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות ברקמות עובריים בעכבר. פרוטוקול זה צריך להיות רלוונטי נרחב לחקר ההפעלה רקמות ספציפיות גן כפי שהיא מתרחשת במהלך ההתפתחות העוברית נורמלי.
Abstract
הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי רב עוצמה כדי לזהות חלבונים: אינטראקציות הכרומטין המתרחשים בהקשר של תאים חיים 1-3. טכניקה זו נוצלה נרחב תאים בתרבית רקמה, ובמידה פחותה ברקמות העיקרי. היישום של שבב לרקמות מכרסם עובריים, במיוחד בזמנים המוקדמים של הפיתוח, הוא מסובך ידי כמות מוגבלת של רקמות ואת ההטרוגניות של התא סוגי רקמות בעובר. כאן אנו מציגים שיטה לבצע באמצעות שבב ביום עובריים ניתק 8.5 (E8.5) העובר. הכרומטין גזוז מעובר אחד E8.5 ניתן לחלק עד חמישה aliquots, המאפשר החוקר חומר מספיק בקרות לחקירה של חלבון מסוים: אינטראקציות הכרומטין.
יש לנו שימוש בטכניקה זו כדי להתחיל לתעד חלבון: אינטראקציות הכרומטין במהלך המפרט של רקמות ספציפיות תוכניות ביטוי גנים. ההטרוגניות של סוגי תאים בעובר בהכרח מגביל את היישום של טכניקה זו, כי התוצאה היא גילוי של חלבון: אינטראקציות הכרומטין בלי להבחין אם האינטראקציות מתרחשות כל, קבוצת משנה של, או סוג תא בודד (ים). עם זאת, בדיקה של רקמות ספציפיות גנים במהלך או לאחר תחילת ביטוי גנים ברקמות ספציפיות אינו ריאלי משתי סיבות. ראשית, immunoprecipitation גורמים רקמות ספציפיות בהכרח מבודד הכרומטין מסוג התא שבו הגורם המתבטא. שנית, immunoprecipitation של coactivators ו ההיסטונים המכיל שלאחר translational שהשינויים הקשורים להפעלת הגן צריך רק למצוא את הגנים רצפים רגולטוריים הגן בסוג התא שבו הגן הוא להיות או הופעל. הטכניקה צריכה להיות ישימה המחקר של רוב רקמות ספציפיות הפעלת גן אירועים.
בדוגמה להלן, השתמשנו E8.5 E9.5 ואת עוברי עכבר לבחון גורם מחייב את מקדם שרירי השלד גן ספציפי. Somites, שהן רקמות מבשר שממנו שרירי השלד של המטען והגפיים יהוו, נוכחים E8.5 9.5-4.5. Myogenin הוא גורם הרגולציה הנדרשים בידול שרירי השלד 6-9. הנתונים מראים כי myogenin קשורה האמרגן משלה E8.5 E9.5 ועוברים. מכיוון myogenin מתבטאת רק somites בשלב זה של התפתחות 6,10, הנתונים מצביעים על כך myogenin אינטראקציות עם האמרגן שלה התרחשו כבר מבשר לתאי שריר השלד ב E8.5 עוברים.
Protocol
Discussion
בפרוטוקול CHIP שתואר, אנו מראים כי myogenin הרגולטור myogenic קשורה האמרגן myogenin ברקמת שריר השלד מבשר נוכח E8.5 E9.5 יחיד עוברים. מחקרים קודמים מאופיין בהרחבה myogenin מחייב תיבת דואר המכיל רצפים, החל הראשונית בניסויים במבחנה ג'ל משמרת שימוש ב-DNA במבחנה מתורגם או מיוצר bacteriall…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM56244 אל ANI, הכולל קרנות הוענק דרך השחזור אמריקאי reinvestment חוק של 2009, ועל ידי NIH R01 GM87130 כדי JARP
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
| Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |
References
- Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis. 47, 559-572 (2009).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19, 425-433 (1999).
- Johnson, K. D., Bresnick, E. H. Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 27-36 (2002).
- Yusuf, F., Brand-Saberi, B. The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl). 211, 21-30 (2006).
- Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat. 202, 59-68 (2003).
- Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cell. 56, 607-617 (1989).
- Edmondson, D. G., Olson, E. N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program. Genes Dev. 3, 628-640 (1989).
- Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature. 364, 532-535 (1993).
- Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature. 364, 501-506 (1993).
- Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis. Nature. 341, 303-307 (1989).
- Brennan, T. J., Olson, E. N. Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization. Genes Dev. 4, 582-595 (1990).
- Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors. Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).
- Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer. Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding. J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).
- French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter. Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).
- Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).
- Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell. 66, 305-315 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).
- Cserjesi, P., Olson, E. N. Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products. Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).
- Braun, T., Arnold, H. H. The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties. Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).
- Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex. Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).
- Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes Dev. 19, 553-569 (2005).
- Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters. EMBO J. 25, 502-511 (2006).
- Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis. J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).
- Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle. Dev Biol. 311, 650-664 (2007).
- Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell. 115, 751-763 (2003).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
