Chromatine immunoprecipitatie assay for Tissue-specifieke genen met behulp van een vroeg stadium muizenembryo's
Summary
Demonstreren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) methode om factor interacties op weefsel-specifieke genen te identificeren tijdens of na het begin van weefsel-specifieke genexpressie in muis embryonale weefsel. Dit protocol moet worden breed toepasbaar voor de studie van weefsel-specifieke gen activatie als het zich voordoet tijdens de normale embryonale ontwikkeling.
Abstract
Chromatine immunoprecipitatie (chip) is een krachtig hulpmiddel om eiwitten te identificeren: chromatine interacties die plaatsvinden in de context van levende cellen 1-3. Deze techniek is breed benut in weefselkweek cellen, en in mindere mate, in primaire weefsel. De toepassing van chip tot knaagdier embryonaal weefsel, met name in de vroege tijden van ontwikkeling, wordt bemoeilijkt door de beperkte hoeveelheid weefsel en de heterogeniteit van cel-en weefseltypen in het embryo. Hier presenteren wij een methode om ChIP uitvoeren met behulp van een los embryonale dag 8.5 (E8.5) embryo. Afgeschoven chromatine van een enkele E8.5 embryo kunnen worden onderverdeeld in maximaal vijf aliquots, die de onderzoeker voldoende materiaal zorgt voor controle en voor het onderzoek van specifieke eiwitten: chromatine interacties.
We hebben gebruikt deze techniek om te beginnen met eiwitten document: chromatine interacties tijdens de specificatie van weefsel-specifieke genexpressie programma's. De heterogeniteit van de celtypes in een embryo beperkt noodzakelijk de toepassing van deze techniek omdat het resultaat is de detectie van eiwit: chromatine interacties zonder onderscheid te maken of de interacties plaatsvinden in alle, een onderdeel van, of een enkele cel type (s). Echter, onderzoek van weefsel-specifieke genen tijdens of na het begin van weefsel-specifieke genexpressie mogelijk is om twee redenen. De eerste, immunoprecipitatie van weefsel specifieke factoren isoleert noodzakelijk chromatine van het celtype waarin de factor wordt uitgedrukt. Ten tweede moet immunoprecipitatie van coactivatoren en histonen met post-translationele modificaties die worden geassocieerd met gen-activering alleen gevonden worden in genen en regulerende sequenties in de cel type waar het gen wordt of is geactiveerd. De techniek moet van toepassing zijn op de studie van de meeste weefsel-specifieke gen activatie gebeurtenissen.
In het onderstaande voorbeeld wordt beschreven, hebben we gebruik gemaakt E8.5 en E9.5 muizenembryo's aan factor binding aan een spier specifiek gen promoter te onderzoeken. Somieten, die de voorloper weefsels waaruit de skeletspieren van de romp en ledematen vormen, zijn aanwezig op E8.5-9,5 4,5. Myogenin is een regulerende factor die nodig is voor de skeletspieren differentiatie 6-9. De gegevens tonen aan dat myogenin is in verband met haar eigen promoter in E8.5 en E9.5 embryo's. Omdat myogenin is alleen uitgedrukt in somieten in dit stadium van ontwikkeling 6,10, de gegevens blijkt dat myogenin interacties met zijn eigen promotor al hebben plaatsgevonden in de skeletspieren voorloper cellen in E8.5 embryo's.
Protocol
Discussion
In de beschreven ChIP protocol, laten we zien dat de myogene regulator myogenin wordt geassocieerd met de myogenin promotor in de skeletspier voorloper weefsel aanwezig is in enkele E8.5 en E9.5 embryo's. Voorafgaande studies hebben uitgebreid gekarakteriseerd myogenin binding aan E doos met sequenties, te beginnen met de eerste in vitro gel shift experimenten gebruik te maken van in vitro vertaald of bacterieel geproduceerd myogenin en radioactief gemerkt DNA dat codeert voor het relevante deel va…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH R01 GM56244 om ANI, welke fondsen toegekend door de Amerikaanse Terugwinning en Reinvestment Act van 2009 omvat, en door het NIH R01 GM87130 naar JARP
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
| Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |
References
- Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis. 47, 559-572 (2009).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19, 425-433 (1999).
- Johnson, K. D., Bresnick, E. H. Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 27-36 (2002).
- Yusuf, F., Brand-Saberi, B. The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl). 211, 21-30 (2006).
- Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat. 202, 59-68 (2003).
- Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cell. 56, 607-617 (1989).
- Edmondson, D. G., Olson, E. N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program. Genes Dev. 3, 628-640 (1989).
- Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature. 364, 532-535 (1993).
- Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature. 364, 501-506 (1993).
- Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis. Nature. 341, 303-307 (1989).
- Brennan, T. J., Olson, E. N. Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization. Genes Dev. 4, 582-595 (1990).
- Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors. Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).
- Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer. Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding. J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).
- French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter. Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).
- Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).
- Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell. 66, 305-315 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).
- Cserjesi, P., Olson, E. N. Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products. Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).
- Braun, T., Arnold, H. H. The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties. Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).
- Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex. Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).
- Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes Dev. 19, 553-569 (2005).
- Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters. EMBO J. 25, 502-511 (2006).
- Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis. J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).
- Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle. Dev Biol. 311, 650-664 (2007).
- Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell. 115, 751-763 (2003).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
