초기 마우스 배아를 사용하는 조직 특정 유전자에 대한 염색질의 Immunoprecipitation 분석
Summary
우리는 마우스 배아 조직에서 조직 특정 유전자 발현의 시작하는 동안이나 이후에 조직 특정 유전자의 상호 작용 요소를 식별하는 방법은 염색질의 immunoprecipitation (칩)을 보여줍니다. 그것이 정상적인 배아 발달 동안 발생으로이 프로토콜은 조직 특정 유전자 활성화의 연구에 대해 광범위하게 적용되어야합니다.
Abstract
1-3 살아있는 세포의 맥락에서 발생하는 염색질의 상호 작용 : 염색질 immunoprecipitation (칩)은 단백질을 식별하는 강력한 도구입니다. 이 기술은 널리 기본 조직에서 낮은 정도 조직 문화 세포에 악용하고있다. 특히 개발 초기 시간에 쥐 배아 조직에 칩의 응용 프로그램, 조직의 한계와 배아의 세포와 조직 유형의 이질에 의해 복잡합니다. 여기 dissociated 배아 하루 8.5 (E8.5) 배아를 사용하여 칩을 수행하는 방법을 제시한다. 염색질 상호 작용 : 단일 E8.5 배아에서 가지각색 염색질은 컨트롤과 특정 단백질의 조사를 위해 조사 충분한 자료를 수있는 다섯 aliquots에로까지 나눌 수 있습니다.
조직 특정 유전자 발현 프로그램의 사양 중 염색질 상호 작용 : 우리는 단백질을 문서로 시작이 기술을 활용합니다. 모든 상호 작용이 발생 여부를 구별하지 않고 염색질 상호 작용의 일부, 또는 하나의 셀 타입 (S) : 결과가 단백질의 검출이기 때문에 배아에서 세포 유형의 이질 반드시이 기술의 응용 프로그램을 제한합니다. 그러나, 도중에 조직 특정 유전자 검사 또는 조직 특정 유전자 발현의 발병 다음 두 가지 이유 때문에 가능합니다. 첫째, 조직 구체적인 요인 immunoprecipitation 반드시 요소가 표현되는 세포 유형에서 염색질를 분리합니다. 둘째, coactivators 및 유전자 활성화와 관련된 포스트 translational 수정을 포함 histones의 immunoprecipitation은 유전자가되는 세포 유형의 유전자와 유전자의 규제 시퀀스에서 찾을 수 있어야하거나 활성화되었습니다. 이 기술은 대부분의 조직 특정 유전자 활성화 이벤트의 연구에 적용해야합니다.
예제는 아래에서 설명에서 우리는 골격근 특정 유전자 프로 모터에 바인딩 요소를 검토 E8.5과 E9.5 마우스 배아를 활용. 트렁크와 사지의 골격 근육이 형성하는 전구체 조직 아르 Somites는 E8.5 – 9.5 4,5에서 존재하고 있습니다. Myogenin는 골격 근육 차별 6-9에 필요한 규제 요소입니다. 데이터 myogenin가 E8.5과 E9.5의 배아 자체 발기인와 관련된 것을 보여줍니다. myogenin에만 개발 6,10이 단계에서 somites 표현이기 때문에, 데이터 자체 모터와 myogenin 상호 작용은 이미 E8.5 태아의 골격 근육 전구체 세포에서 발생한 것을 나타냅니다.
Protocol
Discussion
설명 칩 프로토콜에서는, 우리는 myogenic 조절기 myogenin가 단일 E8.5과 E9.5의 배아에있는 골격근 전구체 조직에서 myogenin 모터와 관련된 것을 보여줍니다. 이전 연구는 광범위 11-20 타겟 유전자 규제 시퀀스의 관련 부분을 인코딩 체외 번역 또는 bacterially 생산 myogenin 및 radiolabeled DNA에 활용하여 체외 겔 이동 실험의 초기부터 시작 시퀀스를 포함하는 E 상자에 바인딩…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 미국의 복구 및 2009 년 재투자 법을 통해 취득 자금을 포함 ANI에 NIH R01 GM56244 지원하고, NIH R01 GM87130에 의해 JARP하는 것이었다
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
| Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |
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