Erken evre Fare Embriyolar kullanarak Doku özel Genler Kromatin Immunoprecipitation Testi
Summary
Biz fare embriyonik doku doku-spesifik gen ekspresyonu başlangıcı sırasında veya sonrasında doku spesifik genlerin faktör etkileşimleri belirlemek için yöntem bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) göstermektedir. Bu protokol, normal embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan doku-spesifik gen aktivasyon çalışması için yaygın olarak uygulanabilir olmalıdır.
Abstract
1-3 canlı hücreler bağlamında ortaya çıkan kromatin etkileşimleri: Kromatin immunoprecipitation (ChIP) protein tanımlamak için güçlü bir araçtır. Bu teknik yaygın birincil doku, doku kültürü hücrelerinde daha az bir ölçüde istismar ve olmuştur. ChIP kemirgen embriyonik gelişimin erken dönemlerinde özellikle doku, uygulaması, sınırlı miktarda doku ve embriyonun hücre ve doku tiplerinin heterojenite karmaşıktır. Burada ayrışmış bir embriyonik gün 8.5 (E8.5) embriyo kullanarak ChIP gerçekleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Kromatin etkileşimleri tek bir E8.5 embriyo makaslanmış kromatin beş alikotları, denetimleri ve özel protein soruşturma için müfettiş yeterli malzeme sağlar içine kadar bölünmüş olabilir.
Özellikleri, doku-spesifik gen ekspresyonu programlar sırasında kromatin etkileşimleri: Biz protein belge başlamak için bu tekniği kullanmış olması. Kromatin etkileşimleri tüm etkileşimler meydana olsun ayrım yapmadan, bir alt kümesidir, ya da tek bir hücre tipi (ler): Sonuç protein saptanması, çünkü bir embriyo hücre tiplerinin heterojenite mutlaka bu tekniğin uygulama kısıtlar. Ancak, sırasında doku spesifik genlerin incelenmesi veya doku belirli bir gen ekspresyonu başlangıcını izleyen iki nedenden dolayı mümkün. İlk olarak, doku spesifik faktörlerin immunoprecipitation mutlaka faktör ifade edilen hücre tipi kromatin izole eder. İkincisi, gen aktivasyonu ile ilişkili olan post-translasyonel modifikasyonlar içeren koaktivatörleri ve histon, immunoprecipitation sadece gen olan hücre tipi genler ve gen düzenleyici dizileri olmalıdır ya da aktif olmuştur. Tekniği, doku-spesifik gen aktivasyonu olayları incelemek için geçerli olmalıdır.
Örneği aşağıda tarif edilen, bağlayıcı faktör incelemek için bir iskelet kas belirli bir gen promoter E8.5 ve E9.5 fare embriyoları kullanılmıştır. E8.5-9.5 4,5 Somitlerin, gövde, kol ve bacakların iskelet kaslarının formunu hangi habercisi dokularda bulunur. Myogenin iskelet kası farklılaşması 6-9 için gerekli düzenleyici bir faktör. Myogenin E8.5 ve E9.5 embriyolar kendi organizatörü ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Myogenin sadece 6,10 gelişme bu aşamada Somitlerin ifade olduğundan, veri kendi organizatörü myogenin etkileşimleri zaten E8.5 embriyolar iskelet kas öncü hücrelerinde meydana gelmiş olduğunu göstermektedir.
Protocol
Discussion
Açıklanan ChIP protokolde, miyojenik regülatör myogenin tek E8.5 ve E9.5 embriyolar bulunan, iskelet kas habercisi dokusunda myogenin organizatörü ile ilişkili olduğunu göstermektedir. Önceki çalışmalar yoğun, 11-20 hedef gen düzenleyici dizilerinin ilgili kısmı kodlama in vitro tercüme veya bakteriyel myogenin ve radyoaktif DNA kullanan in vitro jel vardiya deneylerde ilk başlayan, dizileri içeren E kutusuna bağlayıcı myogenin belirlemiştir . Konvansiyonel C…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma 2009 yılı Amerikan Kurtarma ve yeniden yatırım Yasası ile verilen fonların ANI R01 GM56244 NIH tarafından desteklenen ve NIH R01 GM87130 JARP
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| ChIP Assay Kit | Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore | 17-295 | ||
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS | |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | Gibco Labs, Invitrogen | 12100-061 | High glucose content | |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | Gibco Labs, Invitrogen | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | ||
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit | |
| Penicillin/streptomycin stock solution | Gibco Labs, Invitrogen | 5000 μg/ml concentration | ||
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | ||
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | Millipore | 16-157 | ||
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | ||
| Normal rabbit IgG | Millipore | 12-370 | ||
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | ||
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega | A6001 |
References
- Minard, M. E., Jain, A. K., Barton, M. C. Analysis of epigenetic alterations to chromatin during development. Genesis. 47, 559-572 (2009).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19, 425-433 (1999).
- Johnson, K. D., Bresnick, E. H. Dissecting long-range transcriptional mechanisms by chromatin immunoprecipitation. Methods. 26, 27-36 (2002).
- Yusuf, F., Brand-Saberi, B. The eventful somite: patterning, fate determination and cell division in the somite. Anat Embryol (Berl). 211, 21-30 (2006).
- Buckingham, M., Bajard, L., Chang, T., Daubas, P., Hadchouel, J., Meilhac, S., Montarras, D., Rocancourt, D., Relaix, F. The formation of skeletal muscle: from somite to limb. J Anat. 202, 59-68 (2003).
- Wright, W. E., Sassoon, D. A., Lin, V. K. Myogenin, a factor regulating myogenesis, has a domain homologous to MyoD. Cell. 56, 607-617 (1989).
- Edmondson, D. G., Olson, E. N. A gene with homology to the myc similarity region of MyoD1 is expressed during myogenesis and is sufficient to activate the muscle differentiation program. Genes Dev. 3, 628-640 (1989).
- Nabeshima, Y., Hanaoka, K., Hayasaka, M., Esumi, E., Li, S., Nonaka, I. Myogenin gene disruption results in perinatal lethality because of severe muscle defect. Nature. 364, 532-535 (1993).
- Hasty, P., Bradley, A., Morris, J. H., Edmondson, D. G., Venuti, J. M., Olson, E. N., Klein, W. H. Muscle deficiency and neonatal death in mice with a targeted mutation in the myogenin gene. Nature. 364, 501-506 (1993).
- Sassoon, D., Lyons, G., Wright, W. E., Lin, V., Lassar, A., Weintraub, H., Buckingham, M. Expression of two myogenic regulatory factors myogenin and MyoD1 during mouse embryogenesis. Nature. 341, 303-307 (1989).
- Brennan, T. J., Olson, E. N. Myogenin resides in the nucleus and acquires high affinity for a conserved enhancer element on heterodimerization. Genes Dev. 4, 582-595 (1990).
- Rosenthal, N., Berglund, E. B., Wentworth, B. M., Donoghue, M., Winter, B., Bober, E., Braun, T., Arnold, H. H. A highly conserved enhancer downstream of the human MLC1/3 locus is a target for multiple myogenic determination factors. Nucleic Acids Res. 18, 6239-6246 (1990).
- Braun, T., Gearing, K., Wright, W. E., Arnold, H. H. Baculovirus-expressed myogenic determination factors require E12 complex formation for binding to the myosin-light-chain enhancer. Eur J Biochem. 198, 187-193 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T., Olson, E. Differential trans-activation of a muscle-specific enhancer by myogenic helix-loop-helix proteins is separable from DNA binding. J Biol Chem. 266, 2878-2882 (1991).
- French, B. A., Chow, K. L., Olson, E. N., Schwartz, R. J. Heterodimers of myogenic helix-loop-helix regulatory factors and E12 bind a complex element governing myogenic induction of the avian cardiac alpha-actin promoter. Mol Cell Biol. 11, 2439-2450 (1991).
- Brennan, T. J., Chakraborty, T., Olson, E. N. Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).
- Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo. Cell. 66, 305-315 (1991).
- Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding. Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).
- Cserjesi, P., Olson, E. N. Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products. Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).
- Braun, T., Arnold, H. H. The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties. Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).
- Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex. Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).
- Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. An initial blueprint for myogenic differentiation. Genes Dev. 19, 553-569 (2005).
- Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters. EMBO J. 25, 502-511 (2006).
- Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis. J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).
- Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle. Dev Biol. 311, 650-664 (2007).
- Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell. 115, 751-763 (2003).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).
