Summary
Programmerad celldöd analyser som vanligen används i däggdjur system såsom DNA laddering eller analyser Tunel, är ofta svåra att återge i växter. I kombination med en GUS reporter system, föreslår vi en snabb, växtbaserade övergående analys för att analysera potentiella död egenskaper specifika gener.
Abstract
Vi har utvecklat ett nytt tillfälligt system som växt uttryck som samtidigt uttrycker reporter genen, β-glukuronidas (GUS), med förmodad positiv eller negativ regulatorer av celldöd. I detta system, N. benthamiana bladen är co-infiltrerade med en 35S driven uttryck kassett som innehåller genen som ska analyseras, och GUS vektor pCAMBIA 2301 med hjälp av Agrobacterium stam LBA4404 som ett fordon. Eftersom levande celler krävs för GUS uttryck att inträffa, är förlust av GUS aktiviteten förväntas när detta markörgen är co-uttrycks med positiva regulatorer av celldöd. Likaså ökade GUS aktivitet observeras när anti-apoptotiska gener används jämfört med vektorstyrning. Som framgår nedan har vi använt med framgång detta system i vårt labb för analys av både pro-och anti-döden-spelare. Dessa inkluderar anläggningen anti-apoptotiska Bcl-2 associerad athanoGene (BAG) familj, liksom, känd däggdjursceller inducerar celldöd, såsom BAX. Dessutom har vi använt detta system för att analysera död funktionen av specifika truncations inom proteiner, som skulle kunna ge ledtrådar om eventuella post-translationell modifiering / aktivering av dessa proteiner. Här presenterar vi en snabb och känslig växt baserad metod, som ett första steg i utredningen av dödsfallet funktionen av specifika gener.
Protocol
Nicotiana benthamiana växter som odlas i en temperatur-kontrollerad tillväxt kammare vid 25 ° C. Fullt utbyggt friska blad på 3-6 veckor gamla anläggningar används.
Tips: Bättre resultat erhållits med hjälp av framväxande bladen
1. Agrobacterium övergående infiltration protokoll:
Dag 1
- Streak LB / Rifampicin (25 mikrogram / ml) / Kanamycin (100 mikrogram / ml) agarplattor med glycerol bestånd av Agrobacterium tumefaciens (stam LBA4404) som innehåller lämpliga vektorer med den gen (er) som skall analyseras för celldöd och vektor som innehåller GUS kassetten under en konstitutiv promotor. Inkludera alltid en tom vektor kontroll som en negativ kontroll.
- Inkubera vid 28 ° C i 2 dagar.
Dag 3
- Inokulera 2 ml LB innehåller rifampicin (25 mikrogram / ml) och Kanamycin (100 mikrogram / ml) med en enda koloni från varje LB / Rifampicin / Kanamycin platta tidigare strimmig.
- Inkubera varje kultur genom att skaka vid 28 ° C i 24 timmar vid 200 rpm till maximal tillväxt densitet uppnås.
Tips: klumpar ibland observeras, i vilket fall kulturer måste grundligt resuspenderas (dvs. pipettera upp och ned) innan du fortsätter.
Dag 4
- Efter inkubation, öka den totala volymen till 10 ml med färska LB (med lämplig antibiotika) och acetosyringone (slutlig koncentration 25 M).
- Inkubera varje kultur genom att skaka vid 28 ° C i ytterligare 16 timmar.
Dag 5
- Dagen efter tvätt varje kultur två gånger genom att tillsätta 10 ml (tillsätt inte acetosyringone) infiltration medelstora (10 mM MgSO 4 0,7 H 2 O, 9 mm MES, pH 5.6) och centrifugera vid 4000 xgi 10 minuter vid rumstemperatur.
- Efter den sista centrifugeringen steget, återsuspendera varje kultur i 5 ml infiltration medium som innehåller acetosyringone (100 M).
- Mät OD 600 Nm, mätningar mellan 0,1 och 0,9 är acceptabla.
Tips: OD 600 Nm i så låg som 0,1 har använts utan problem kan dock högre ODS producera mer konsekventa resultat. - Inkubera kulturer ytterligare 3 timmar att förbereda Agrobacterium kulturer infektion.
- Blanda kulturer innehåller genen (er) som skall analyseras och den negativa kontrollen (Agrobacterium innehåller tomma vektor) i förhållandet 1:1 med kulturen som innehåller GUS kassetten.
- Infiltrera abaxial (under)-sidan om nya, framväxande bladen med hjälp av en 1 ml nål mindre spruta (Fig. 1).
Tips: Infiltrera både negativa kontrollen blandningen (tom vektor + GUS kassett) och blandningen innehåller genen som ska analyseras (gen x + GUS kassett) på motsatta blad av samma växt. Använd tre exemplar växter för varje behandling. - 3 dagar efter infiltration punktskatter infiltrerade blad och analys för GUS protein uttryck.
2. Histokemiska GUS analys
Dag 8
- Dammsug infiltrera X-gluc substrat mediet i exciderad bladen.
- Inkubera i mörker vid rumstemperatur över natten eller tills distinkt blå färgning visas.
Dag 9
- Skölj i distillated vatten.
- Inkubera i 70% etanol tills klorofyll tas bort, sedan överföra till destillerat vatten igen. Visuellt bedöma GUS uttryck nivåer.
3. Fluorometriska MUG analysen:
Dag 8
- Isolera totalt protein genom slipning infiltrerade löv-skivor i en mortel med hjälp av flytande kväve. Tillsätt 100 ul GUS extraktionsbuffert (50 mm napi pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-lauroylsarcosine natriumsalt, β-merkaptoetanol (0,7 l / ml) och samtidigt hålla provet på is.
- Centrifugera fjädring på 14.000 gi 5 min vid 4 ° C och ta supernatanten som totalt lösligt protein.
- Mät koncentration med hjälp av en nanodrop enligt tillverkarens anvisningar.
- Justera proteinkoncentrationen till 100 mikrogram av det totala lösligt protein för varje prov genom GUS extraktionsbuffert.
- Lägg MUG substrat (4-methylumbelliferyl-β-D-glukuronid trihydrat) upprättad i GUS extraktionsbuffert till en slutlig koncentration av 2 mm. En total volym av 100 mikroliter per prov (protein + MUG substrat) bör räcka.
- Inkubera reaktioner för 1 timme vid 37 ° C.
- Sluta reaktioner genom att tillsätta 800 l av GUS stopp buffert (0,2 M Na 2 CO 3).
- Mät fluorescensen på en platta läsare på en excitation våglängd på 365 nm och utsläpp våglängden 455 nm och jämföra värdena till en MU standardkurvan. Rapport nivåer av GUS verksamhet som nmol ME / mikrogram totalt lösligt protein / min.
4. Aktier och lösningar:
- Acetosyringone (1 m) lager (FW = 196,2 g)
- Kanamycin (100 mg / ml) lager - förbereda dH 2 0 - filter sterilisera
- Rifampicin (25 mg / ml) lager - förbereda DMSO
- Luria-Bertani (LB) flytande tillväxt media: (1L)
1% (w / v) Bacto-trypton, 10 g
0,5% (w / v) Bacto-jästextrakt, 5 g
170 mm natriumklorid 10 g
pH - 7 - Acetosyringone (25 M) = 25 l av en 1 M lager i en slutlig volym på 1 ml
- Infiltration Medium: (1L)
10 mM MgSO 4 0,7 dH 2 0 (FW = 246,48 g), 2,4648 g
9 mm MES (FW = 213,25 g), 1,91925 g
pH - 5,6 - Acetosyringone (100 mikroM) = 100 l av en 1M lager i en slutlig volym på 1 ml
- GUS Extraktionsbuffert
50 mM napi pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% N-lauroylsarcosine natriumsalt, β-merkaptoetanol (0,7 l / ml) - 2x Fosfatbuffert
0,2 NaH 2 PO 4 och 0,2 M Na 2 HPO 4 pH 7 - X-Gluc substratlösning
Lös upp 1 mg 5-bromo-4-klor-3-indolyl BD-glukuronid (X-Gluc) i 0,1 ml metanol. Tillsätt 1 ml 2x fosfatbuffert, 20 l 0,1 miljoner kaliumferricyanid, 10μl Triton X-100 10% och 850 ìl distillated vatten.
5. Representativa resultat:
Efter detta protokoll, förlust av GUS uttryck förväntades när celldöd inträffar. Vi har samtidigt uttryckt reporter genen, β-glukuronidas (GUS) med en medlem av CYTO-skyddande Arabidopsis Bcl-2 associerad athanoGene (BAG) familj. Vi samarbetar infiltrerat N. benthamiana blad med en 35S driven BAG uttryck kassett och GUS vektor pCAMBIA 2301 med hjälp av Agrobacterium stam LBA4404. Som visas i figur 2, var en synlig ökning GUS färgning observerades efter denna infiltration. Omvänt gäller att när den kända pro-apoptotiska medlem av BCL-2 familjen BAX användes var en markant minskning av GUS färgning observeras (figur 2). I båda dessa fall var GUS uttryck tydligt annorlunda jämfört med kontrollgruppen. Men när skillnaden i uttrycket är mindre tydlig, kan fluorometriska MUG analyser göras för att quanitate GUS uttryck.
Figur 1. Exempel på Agrobacterium blandning infiltration av abaxial sidan av N. benthamiana lämnar använda en 1 ml nål-mindre spruta.
Figur 2. En GUS vektor var co-uttrycks i N. benthamiana blad med anti-döden-genen, och en känd inducerare av celldöd. GUS nivåerna jämfördes med en tom vektor kontroll (GUS kontroll).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | VWR international | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4’-hydroxy-3’,5’-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR international | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR international | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR international | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR international | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR international | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR international | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR international | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR international | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma-Aldrich | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR international | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone(MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR international | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
References
- Jefferson, R. A. GUS fusions: , β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3901 (1987).
- Nishihara, M. Expression of the β-Glucuronidase Gene in Pollen of Lily (Lilium longiflorum), Tobacco (Nicotiana tabacum), Nicotiana rustica, and Peony (Paeonia lactiflora) by Particle Bombardment. Plant Physiol. 102, 357-357 (1993).
- Hodal, L. Plant Science. 87, 115-115 (1992).
- Kabbage, M. The BAG proteins: a ubiquitous family of chaperone regulators. Cell Mol. Life Sci. . 65, 1390-1390 (2008).
- Kang, C. H. AtBAG6, a novel calmodulin-binding protein, induces programmed cell death in yeast and plants. Cell Death Differ. 13 (1), 84-84 (2006).
- Yan, J. Plant Science. 165 (1), 1-1 (2006).
- Takayama, S., Reed, J. C. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol. 3 (10), 237-237 (2001).
- Takayama, S. Cloning and functional analysis of BAG-1: a novel Bcl-2-binding protein with anti-cell death activity. Cell. 80 (2), 279-279 (1995).
- Vitha, S. Quantitative β-glucuronidase assay in transgenic plants. Biol. Plant. 35, 151-151 (1993).
- Otha, S. Construction and Expression in Tobacco of a β-Glucuronidase (GUS) Reporter Gene Containing an Intron Within the Coding Sequence. Plant Cell Physiol. 31, 805-805 (1990).
