高通量筛选和生物传感与荧光 C。线虫菌株
Summary
液为基础的培养和分配过程<em> C。线虫</em>菌株表达荧光记者蛋白质的描述，不需要昂贵的分拣设备。这种方法可以适用于众多诱导<em> C。线虫</em>基因药物发现或污染物的生物传感。
Abstract
高通量筛选（HTS）是一个强大的方法确定的生物过程的化学调制。然而，在使用细胞培养模型的屏幕中发现了许多化合物， 经常 发现 在 1-2体内有毒或药物活动。在整体动物模型的筛选，可以帮助避免这些缺陷，并简化药物开发的路径。
线虫是一个多细胞生物模型，非常适合用于高通量筛选。这是小（<1毫米），并可以在经济上的培养，在液体中的处方。 C。 线虫也是最听话的实验动物模型允许快速和详细的鉴定药物模式的行动之一。
我们描述了培养协议，并配发荧光的 C株线虫为高通量筛选化学库或改变特定基因的表达的环境污染物的检测。发展同步蠕虫的大量液体培养基中生长，收获，洗涤，并悬浮在一个定义的密度。蠕虫，然后添加到黑，平底的384孔板使用蠕动的液体分配器。从一种化学品库或测试样本（例如，水，食物，或土壤）的小分子可以被添加到井与蠕虫体内，实时荧光强度与荧光酶标仪测定。这种方法可以适应任何C.诱导基因一个合适的记者提供的线虫。许多诱导应力和发展的转录途径是定义在 C 线虫和GFP的转基因记者菌株已经存在许多其中4人。当与适当的转基因记者结合，我们的方法可用于屏幕通路调制器，或发展为强大的生物传感器检测环境污染物。
我们证明我们的C 。 线虫文化和配药协议，高温超导实验，我们发展到显示器的 C. 线虫第“N”白领转录因子SKN – 1。 SKN – 1和哺乳动物同源Nrf2的激活过程中的氧化和异生强调5-10细胞保护基因。 Nrf2的保护哺乳动物和许多与年龄有关的，如癌症，神经退行性疾病，和慢性炎症疾病已成为一个主要的化疗目标11-13。我们的实验是基于GFP的转基因SKN – 1靶基因 GST -4 14记者，编码谷胱甘肽- S转移6。 商品及服务税-4记者也是一个传感器异生和氧化的化学物质，激活SKN – 1，可用于检测水平低的污染物，如丙烯酰胺和甲基水银15-16。
Protocol
Discussion
我们提出了培养方法，并配发大量的转基因线虫。培养蠕虫使用的设备是标准的实验室进行分子克隆和液体处理和设备的荧光微孔板处理大量的实验室标准。配药的活C.大量的其他方法线虫需要昂贵的粒子分拣设备19。 Pgst – 4：绿色荧光蛋白检测可用于屏幕上的第“N”白领转录因子的小分子调制器和检测异生和氧化剂污染物在环境和食品样品14,16。乐百氏诱导?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
线虫转基因线虫遗传学中心（美国明尼苏达大学，明尼阿波利斯，明尼苏达州）。这项工作是支持由美国国立卫生研究院R21授予NS0667678 – 01到金水。参加所有作者在收集，分析和解释数据。 CKL，KS和KPC参加了编写和修改的手稿。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy™ HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled (352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nunc | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , (2009).
- Park, S. -. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. . C. elegans, a Practical Guide. , (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
