High-throughput screening 'en biosensing met fluorescerende C. elegans Stammen
Summary
Een procedure voor vloeibare-based kweken en verstrekking van<em> C. elegans</em> Stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten is beschreven dat betekent niet duur sorteren apparatuur nodig. Deze aanpak kan worden toegepast op tal van induceerbare<em> C. elegans</em> Genen voor drug discovery of biosensing van verontreinigende stoffen.
Abstract
High-throughput screening (HTS) is een krachtige aanpak voor het identificeren van chemische modulatoren van biologische processen. Er zijn echter vele stoffen die in schermen met behulp van celkweek modellen vaak te toxisch of farmacologisch inactief worden in vivo 1-2. Screening in hele diermodellen kunnen helpen deze valkuilen te vermijden en het stroomlijnen van de weg naar de ontwikkeling van geneesmiddelen.
C. elegans is een meercellig organisme model zeer geschikt voor HTS. Het is klein (<1 mm) en economisch kunnen worden gekweekt en afgeleverd in vloeistoffen. C. elegans is ook een van de meest handelbare experimenteel diermodellen waarbij een snelle en gedetailleerde identificatie van de drug mode-van-actie 3.
Beschrijven we een protocol voor het kweken en het doseren van tl-stammen van C. elegans voor high-throughput screening van chemische bibliotheken of het opsporen van milieuverontreinigende stoffen die de expressie van een specifiek gen wijzigen. Grote aantallen ontwikkelingsgebied gesynchroniseerde wormen worden gekweekt in vloeibare cultuur, geoogst, gewassen en opgehangen in een bepaalde dichtheid. Wormen zijn vervolgens toegevoegd aan zwarte, platte bodem 384-wells platen met behulp van een peristaltische vloeistof dispenser. Kleine moleculen van een chemische bibliotheek of proefmonsters (bijvoorbeeld water, voedsel, of bodem) kunnen worden toegevoegd aan putten met wormen. In vivo, real-time fluorescentie-intensiteit wordt gemeten met een fluorescentie microplaat reader. Deze methode kan worden aangepast aan een induceerbaar gen in C. elegans waarvoor een geschikte verslaggever beschikbaar is. Veel induceerbare stress en ontwikkelingsstoornissen transcriptionele paden zijn goed gedefinieerd in C. elegans en GFP transgene reporter stammen al bestaan voor velen van hen 4. In combinatie met de juiste transgene verslaggevers, kan onze methode worden gebruikt voor het screenen op pad modulatoren of de robuuste biosensor testen te ontwikkelen voor milieucontaminanten.
We tonen onze C. elegans cultuur en het doseren van het protocol met een HTS-test hebben we ontwikkeld om de C. te controleren kraag transcriptie elegans cap 'n' factor SKN-1. SKN-1 en de zoogdier-homoloog Nrf2 activeren cytoprotectieve genen tijdens oxidatieve stress-en xenobiotische 5-10. Nrf2 beschermt zoogdieren uit tal van leeftijd-gerelateerde aandoeningen zoals kanker, neurodegeneratie, en chronische ontstekingen en is uitgegroeid tot een belangrijke chemotherapeutische doelwit 11-13. Onze test is gebaseerd op een GFP transgene verslaggever voor de SKN-een target-gen gst -4 14, dat codeert voor een glutathion-s-transferase 6. De gst -4 reporter is ook een biosensor voor xenobiotische en oxidatieve stoffen die SKN-1 te activeren en kan gebruikt worden om lage niveaus van verontreinigende stoffen zoals acrylamide en methyl-kwik 15-16 te detecteren.
Protocol
Discussion
We presenteren een methode voor het kweken en het doseren van grote aantallen transgene nematoden. De apparatuur wordt gebruikt voor het kweken van wormen is standaard voor de laboratoria die moleculaire klonen en de liquid handling-en fluorescentie-apparatuur is standaard voor laboratoria het verwerken van grote aantallen microtiterplaten. Andere methoden van doseren grote aantallen van de live C. elegans dure deeltje gesorteerd apparatuur 19. De Pgst-4:: GFP assay kan worden gebruikt voor …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. elegans transgenen werden verstrekt door de Caenorhabditis Genetics Center (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Dit werk werd ondersteund door NIH R21 verlenen NS0667678-01 naar KS. Alle auteurs namen deel aan het verzamelen, analyseren en interpreteren van gegevens. CKL, KS, en KPC deelgenomen aan het schrijven en de herziening van het manuscript.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy™ HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled (352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nunc | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , (2009).
- Park, S. -. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. . C. elegans, a Practical Guide. , (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
