Floresan ile yüksek verim Tarama ve Biyoalgılayıcı C. elegans Suşlarının
Summary
Sıvı tabanlı kültür ve dağıtımı için bir prosedür<em> C. elegans</emFloresan muhabiri proteinleri ifade> suşları pahalı sıralama ekipman gerektirmez açıklanmıştır. Bu yaklaşım çok sayıda indüklenebilir uygulanabilir<em> C. elegans</em> Ilaç keşfi veya bulaşanların biyoalgı için genlerin.
Abstract
Yüksek verim tarama (HTS), biyolojik süreçler kimyasal modülatörleri tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Ancak, hücre kültürü modelleri kullanarak ekranlar tanımlanan birçok bileşikler genellikle, in vivo 1-2 toksik ya da farmakolojik olarak inaktif olarak bulunmuştur . Tüm hayvan modellerinde de Eleme Bu tuzaklardan kaçınmak ve ilaç geliştirme yolunu düzene yardımcı olabilir.
C. elegans, iyi HTS için uygun bir çok hücreli bir model organizmadır. Küçük (<1 mm) ve ekonomik kültürlü ve sıvılarda reçete edilmesi C. elegans, ilaç modu-aksiyon 3 hızlı ve ayrıntılı kimlik izin, en deneysel olarak izlenebilir hayvan modellerinde de biridir.
Biz kültür için bir protokol tanımlayan ve C floresan suşları dağıtım kimyasal kütüphaneleri veya belirli bir gen ifadesini değiştiren çevresel kirleticiler tespit yüksek verim tarama için elegans. Çok sayıda gelişimsel senkronize solucanlar, sıvı kültüründe yetişen hasat, yıkanmış ve belirli bir yoğunlukta asılı. Worms peristaltik bir sıvı dağıtıcı kullanarak siyah, düz tabanlı 384-kuyucuğu sonra eklenir. Küçük moleküllerin kimyasal bir kütüphane ya da test örnekleri (örneğin, su, gıda, veya toprak), solucanlar ile kuyu eklenebilir. In vivo olarak, gerçek zamanlı floresan bir floresan mikroplak okuyucu ile ölçülür . Bu yöntem, C herhangi bir indüklenebilir gen adapte edilebilir uygun bir muhabir kullanılabilir olduğu elegans. Birçok indüklenebilir stres ve gelişim transkripsiyonel yollar C ile tanımlanır elegans ve GFP transgenik muhabiri suşları zaten onları 4 pek çok var. Uygun transgenik gazetecilere ile kombine edildiğinde, yöntem yolağı modülatörleri ekrana veya çevresel kirleticiler için sağlam bir biyosensör deneyleri geliştirmek için kullanılabilir.
Biz C. göstermektedir elegans kültür ve dağıtım protokolü bir HTS testi ile C. izlemek için geliştirilen elegans kap 'n' yaka transkripsiyon faktörü SKN-1. SKN-1 ve memeli homologu Nrf2 5-10 ve ksenobiyotik oksidatif stres sırasında sitoprotektif genler aktif hale getirin. Nrf2 memeliler, kanser nörodejenerasyon ve kronik inflamasyon gibi pek çok yaşa bağlı bozukluklar korur ve büyük bir kemoterapötik hedef 11-13 haline gelmiştir. Tahlil -4 SKN-1 hedef geni gst 14 GFP transgenik muhabiri dayalı , glutatyon-s transferaz 6 kodlar. Gst -4 muhabiri SKN-1 etkinleştirin ve akrilamid ve metil-civa 15-16 gibi kirleticilerin düşük seviyelerde tespit etmek için kullanılan olabilir ksenobiyotik ve oksidatif kimyasallar için de bir biyosensör.
Protocol
Discussion
Biz kültür için bir yöntem mevcut ve transgenik nematodların çok sayıda dağıtım. Kültür solucanları için kullanılan ekipman, moleküler klonlama gerçekleştiren laboratuarlar için standart ve sıvı taşıma ve çok sayıda mikropleytin işleme laboratuarları için standart floresan ekipman. Diğer çok sayıda canlı C. dağıtım yöntemleri elegans pahalı ekipmanlar 19 sıralama parçacık gerektirir. Pgst-4: GFP tahlil kap 'n' yaka transkripsiyon fakt?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. elegans transgenlerin Caenorhabditis Genetik Merkezi (Minnesota Üniversitesi, Minneapolis, MN) tarafından verilmiştir. Bu çalışma NIH R21 hibe NS0667678 KS-01 tarafından desteklenmiştir. Tüm yazarlar katıldı toplanması, analizi ve verilerin yorumlanması. CKL, KS ve KMG yazının yazımı ve gözden geçirilmesi katıldı.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy™ HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled (352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nunc | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
References
- Simeonov, A. Quantitative high-throughput screen identifies inhibitors of the Schistosoma mansoni redox cascade. PLoS Negl Trop Dis. 2, e127-e127 (2008).
- Giacomotto, J., Segalat, L. High-throughput screening and small animal models, where are we. Br J Pharmacol. 160, 204-216 (2010).
- Artal-Sanz, M., de Jong, L., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans: a versatile platform for drug discovery. Biotechnol J. 1, 1405-1418 (2006).
- An, J. H., Blackwell, T. K. SKN-1 links C. elegans mesendodermal specification to a conserved oxidative stress response. Genes Dev. 17, 1882-1893 (2003).
- Choe, K., Przybysz, A., Strange, K. The WD40 repeat protein WDR-23 functions with the CUL4/DDB1 ubiquitin ligase to regulate nuclear abundance and activity of SKN-1 in Caenorhabditis elegans. Mol Cell Biol. 29, 2704-2715 (2009).
- Hasegawa, K. Acrylamide-responsive genes in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicol. Sci. 101, 215-225 (2008).
- Tullet, J. M. A. Direct inhibition of the longevity-promoting factor SKN-1 by insulin-like signaling in C. elegans. Cell. 132, 1025-1038 (2008).
- Oliveira, R. P. Condition-adapted stress and longevity gene regulation by Caenorhabditis elegans SKN-1/Nrf. Aging Cell. , (2009).
- Park, S. -. K., Tedesco, P. M., Johnson, T. E. Oxidative stress and longevity in Caenorhabditis elegans as mediated by SKN-1. Aging Cell. 8, 258-269 (2009).
- Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S., Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1-Nrf2 pathway. Antioxid Redox Signal. , (2010).
- Kwak, M. K., Kensler, T. W. Targeting NRF2 signaling for cancer chemoprevention. Toxicol Appl Pharmacol. 244, 66-76 (2010).
- Leiser, S. F., Miller, R. A. Nrf2 signaling, a mechanism for cellular stress resistance in long-lived mice. Mol Cell Biol. 30, 871-884 (2010).
- Link, C. D., Johnson, C. J. Reporter transgenes for study of oxidant stress in Caenorhabditis elegans. Methods Enzymol. 353, 497-505 (2002).
- Vanduyn, N., Settivari, R., Wong, G., Nass, R. SKN-1/Nrf2 inhibits dopamine neuron degeneration in a Caenorhabditis elegans model of methylmercury toxicity. Toxicol Sci. , (2010).
- Hasegawa, K. A rapid and inexpensive method to screen for common foods that reduce the action of acrylamide, a harmful substance in food. Toxicol Lett. 175, 82-88 (2007).
- Chase, D. L., Pepper, J. S., Koelle, M. R. Mechanism of extrasynaptic dopamine signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 7, 1096-1103 (2004).
- Hope, I. A. . C. elegans, a Practical Guide. , (2005).
- Pulak, R. Techniques for analysis, sorting, and dispensing of C. elegans on the COPAS flow-sorting system. Methods Mol Biol. 351, 275-286 (2006).
