Criblage à haut débit et de biodétection avec fluorescent C. elegans Souches
Summary
Une procédure de liquides à base de culture et de la distribution de<em> C. elegans</em> Souches exprimant des protéines rapporteur fluorescent est décrite qui ne nécessite pas d'équipement de tri coûteux. Cette approche peut être appliquée à de nombreux inductible<em> C. elegans</em> Des gènes pour la découverte de médicaments ou de biocapteurs de contaminants.
Abstract
Criblage à haut débit (HTS) est une approche puissante pour identifier des modulateurs chimiques des processus biologiques. Toutefois, de nombreux composés identifiés dans les écrans en utilisant des modèles de culture cellulaire sont souvent considérés comme toxiques ou pharmacologiquement inactive in vivo 1-2. Dépistage dans les modèles animaux entiers peuvent aider à éviter ces écueils et de rationaliser la voie du développement de médicaments.
C. elegans est un organisme modèle multicellulaire bien adapté pour HTS. Il est de petite taille (<1 mm) et peut être économiquement cultivé et distribué dans les liquides. C. elegans est également l'un des modèles animaux les plus dociles expérimentale permettant une identification rapide et détaillée de la drogue mode d'action 3.
Nous décrivons un protocole pour la culture et la distribution des souches fluorescentes de C. elegans pour criblage à haut débit de chimiothèques ou la détection de contaminants environnementaux qui modifient l'expression d'un gène spécifique. Un grand nombre de vers de développement synchronisé sont cultivées en milieu liquide, récoltées, lavées, et suspendu à une densité définie. Worms sont ensuite ajoutés au noir, fond plat, plaques 384 puits en utilisant un distributeur péristaltique liquide. Les petites molécules à partir d'une bibliothèque chimique ou échantillons de test (par exemple, eau, nourriture, ou le sol) peuvent être ajoutés aux puits avec des vers. In vivo, en temps réel l'intensité de fluorescence est mesurée avec un lecteur de microplaques à fluorescence. Cette méthode peut être adapté à n'importe quel gène inductible en C. elegans pour lequel un journaliste convenable est disponible. Beaucoup de stress inductible et de développement des voies de transcription sont bien définis dans C. elegans et les souches transgéniques GFP journaliste existent déjà pour beaucoup d'entre eux 4. Lorsqu'il est combiné avec les journalistes appropriée transgéniques, notre méthode peut être utilisée pour dépister les modulateurs voie ou à développer de solides analyses biocapteur pour les contaminants environnementaux.
Nous démontrons notre C. elegans culture et de distribution de protocole avec un test HTS nous avons développé pour surveiller le C. 'n' elegans bouchon facteur de transcription cols SKN-1. SKN-1 et son homologue de Nrf2 activer des gènes de mammifères cytoprotecteur durant le stress oxydatif et des xénobiotiques 5-10. Nrf2 protège les mammifères de nombreuses liée à l'âge des troubles tels que le cancer, la neurodégénérescence, et de l'inflammation chronique et est devenue une cible majeure chimiothérapeutiques 11-13. Notre analyse est basée sur une GFP journaliste transgéniques pour le SKN-1 gène cible -4 TPS 14, codant pour une glutathion-S 6 transférase. La TPS est également journaliste de -4 un biocapteur pour les produits chimiques xénobiotiques et oxydatif qui activent SKN-1 et peut être utilisé pour détecter de faibles niveaux de contaminants tels que l'acrylamide et le méthyl-mercure, 15-16.
Protocol
Discussion
Nous présentons une méthode pour la culture et la distribution de grands nombres de nématodes transgéniques. L'équipement utilisé pour les vers de la culture est la norme pour les laboratoires effectuant le clonage moléculaire et la manipulation de liquides et de l'équipement de fluorescence est standard pour les laboratoires de traitement de grands nombres de microplaques. D'autres méthodes de distribution grand nombre de vivre C. elegans nécessitent des particules onéreux équipement de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C. elegans transgènes ont été fournis par le Centre de Génétique Caenorhabditis (Université du Minnesota, Minneapolis, MN). Ce travail a été soutenu par le NIH R21 octroi NS0667678-01 à KS. Tous les auteurs ont participé à la collecte, l'analyse et l'interprétation des données. CKL, KS, et KPC participé à la rédaction et la révision du manuscrit.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| LB broth | Research Products International Corp. | L24066 | |
| Terrific broth | Research Products International Corp. | T15100 | |
| Synergy™ HT Multi-mode Microplate Reader | BioTek | Filters: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em | |
| MicroFlo Select Dispenser | BioTek | ||
| Worm dispensing flask | Southern Scientific Inc., Micanopy, FL | Custom assembled (352) 284-2531 | |
| 384 microplates | Greiner Bio-One | 5678-1209 | |
| Breathable sealing tape | Nunc | 241205 | |
| (5-hydroxy-p-naphthoqinone) Juglone | ACROS | 121640010 | Juglone is dissolved in DMSO |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D-5879 | |
| C. elegans transgenic strain | Author’s laboratory | VP596 | Pgst-4::GFP and Pdop-3::RFP |
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