우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.
날짜하려면 적합한 인간 심장 세포 소스의 부족 중 세포 기반 이식이나 심장 조직 공학 1-3으로 재생 인간 myocardium의 주요 좌절되었습니다. Cardiomyocytes은 출생 직후 말기 – 차별되고 세포 분열 따위에 의해 번식하는 능력을 잃게됩니다. 같은 골수 또는 탯줄 혈액 등 다른 소스에서 파생된 줄기 / 전구 세포가, 1-3 심장에 이식 다음과 수축성 심장 근육 세포에 야기할 수있는 증거는 없습니다. 손상된 심장 근육을 재생 또는 수리 필요는 성인 줄기 세포 치료, 중 내생 또는 1-3 셀 전송을 통해 충족되지 않았습니다. 유전자 안정적인 인간의 배아 줄기 세포 (hESCs)가 필요 혈통에 제한 인간의 체세포의 대형 공급의 체외의 유도에 대한 pluripotent 저수지를 proffering, 무제한 확장 능력과 무제한 소성을 가지고수리 및 재생 4,5니다. 기증 장기의 부족과 세계적으로 급성 심장 혈관 질환의 유행으로 인해, 다른 접근 방법으로 개발 hESC 기반 요법에 강렬한 관심이 있습니다. 그러나, 원하는 표현형에 효율적이고 예측할 수 pluripotent hESCs의 다양한 차별의 가능성을 채널하는 방법을 개발 연구와 임상 번역 모두에 큰 도전을했습니다. 종래의 접근 방식은 종종 phenotypic 이질과 불안정, 따라서, tumorigenicity 6-8의 높은 위험 (에 회로도를 참조하여 다음입니다 비효율적과 지나치게 혈통 – 노력의 결과로, 자연 배아 계층 분화를 통해 pluripotent 세포의 멀티 혈통 기울기에 의존 그림. 1A). 또한, 정의되지 않은 외국인 / 동물 생물 학적 보조 및 / 또는 일반적으로 격리, 확장, 그리고 hESCs의 분화에 사용되었습니다 모이통는 세포 speciali 직접 사용 할 수 있습니다9-11 문제 환자에 이식 제드 자형의 것. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 임상 – 적합한 hESCs의 드 노보 유도를위한 플랫폼으로 제공, 필요한 hESCs의 epiblast pluripotence를 유지하기에 충분 정의된 문화 시스템의 요소를 해결하고 효과적으로 임상 – 관련 lineages 방향으로 균일하게 같은 hESCs를 지시하고있다 작은 분자로 12 (그림 설계도를 참조하십시오. 1B). 작은 분자와 성장 요인의 다양한 상영 후, 우리는 이러한 정의 조건이 있습니다 (그림 2 더 높은 효율과 인간의 박동 cardiomyocytes을 생성 cardioblasts로 진행 pluripotent의 hESCs에서 직접 cardiomesoderm의 사양을 유발하는 니코틴 (NAM)가 충분한 렌더링 발견 ). 우리는 잘 제어 효율적인 파생을 가능하게 개입 멀티 혈통 embryoid 바디 단계없이 pluripotent hESCs에서 직접 cardioblasts의 유도에 대한 조건을 정의세포 기반 치료제에 대한 개발 단계의 스펙트럼에 걸쳐 인간의 심장 세포의 대형 공급하고 있습니다.
발달 연구와 임상 번역 모두의 주요 과제 중 하나는 효율적이고 예측할 원하는 표현형에 pluripotent 인간 줄기 세포의 광범위한 차별 잠재력을 채널로하는 방법되었습니다. 이러한 세포에 여러 혈통 골재 단계를 통해 이동하여 모든 세균 레이어의 세포로 체외에서 자발적으로 구별 수 있지만 hESC – 파생 전용 멀티 혈통 집계 (embryoid 기관), 세포의 매우 작은 분수 (<2 %) 자발적 cardiomyocytes 13-15 (그림 1A)로 구분. 다음 immunoselection, cardiomyocytes의 풍부한 인구가 동물 모델 13 마음에 분사 다음과 같은 기계적 및 전자 손상된 myocardium의 기능을 구조하기 위해 생물 학적 맥박 조정기와 같은 기능을 수있었습니다. 설치류 infarcted 모델, engrafted hESC – 파생 심장 progenies 살 및 12 주가 성숙 수 있었던, 그리고 부분적으로 remuscular부상자 마음을는 어때하고 수축성 기능 14,15을 향상시킵니다. 그러나, 다중 혈통 pluripotent 세포의 분화 및 tumorigenicity 다음 이식의 높은 위험을 통해 인간의 심장 – 최선을 다하고 세포를 생성하는 비효율 추가 임상 번역을 방해했습니다. 심장 표현형에 독점적으로하고 예측할 수 pluripotent hESCs의 다양한 차별의 가능성을 채널 전략을 개발하는 것은 harnessing 심장 분야에서 hESC 생물학의 능력에 매우 중요합니다. 특정 혈통에 인간의 pluripotent 줄기 세포의 일정한 변환을 달성하기 위해, 우리는 임상 – 관련 혈통 특정에 독점적으로 pluripotent의 hESCs의 잘 제어 효율 유도 조건을 식별하는 undifferentiated hESCs의 확산을 할려고 수있는 정의된 문화 시스템을 채용 작은 분자의 단순한 제공 (그림의 1B)에 의해. 우리는 직접 P로부터 유도된 심장 니코틴 – 혈통 노력을 발견더 높은 효율 (그림 2)와 함께 cardiomyocytes을 치고으로 진행되고 정의 문화에 따라 luripotent hESCs. Nkx2.5은 인간의 선천성 심장 질환 (CHD), 가장 일반적인 인간의 선천성 16과 관련된 유전자의 정상적인 심장 개발 및 돌연변이에 대한 필수 evolutionally 보존 homeobox의 전사 인자이다. Nkx2.5 표현까지 모든 척추 동물에서 검사 심장 전구체 세포에 대한 최초의 표지이며 적절한 심장 septation 및 형성 / 전기 전도 시스템 16 성숙을 위해 필수적입니다. 척추 동물에서 초기 Nkx2.5 표현의 증상과 패턴은 대략 초기 embryogenesis의 심장 사양의 타이밍 지역과 일치하고, Nkx2.5 유전자는 심장 16 개발을 통해 표현되고 있습니다. 우리 hESC 모델에서 NAM은 심장 특정 transcri의 표현을 장려하여 pluripotent hESCs에서 직접 심장병 유도를 실행하는 데 등장인간의 배아 cardiogenesis에 pluripotent epiblast에서 cardiomesoderm의 사양을 에뮬레이트 수 과정에 ption 팩터 Nkx2.5. 미래 연구는 재생 요법에 대한 임상 – 관련 lineages를 파생하면 hESC의 pluripotent 운명의 작은 분자 중재 직접 제어 및 모듈 레이션을위한 방법을 포장 수있는, 대안으로 인간 심장 개발 유전 및 epigenetic 조절 분자를 보여줄 것입니다. NAM 처리하지 않고, <2 % hESCs가 cardiomyocytes 12-15을 치고으로 자발적인 차별을 받아야합니다. NAM 치료와 함께, 우리는 인간의 배아 심장 개발에 12 에뮬레이트 수도 과정에서 정의하는 문화에 따라 유지 hESCs에서> 95% 배아 심장 엽 성의 전구 물질과> 50 % 구타 cardiomyocytes를 생성할 수있게되었습니다. 최근 알려진 심장 – 운명 결정하는 유전자는 <0.5 % 17, 18의 낮은 효율성 포스트 산후 박동 cardiomyocytes에 마우스 섬유아 세포를 transdifferentiate하는 데 사용되었습니다 </>를 한모금. 그러나, 다시 프로그램 체세포 역사적으로 비정상적인 유전자 발현 및 장애 치료 유틸리티를 19-21로 가속 노화와 관련된되었습니다. 마지막으로, 우리가 여기 설립 프로토콜은 내부 세포 덩어리 (ICM) 또는 4,5 인간 blastocyst의 epiblast에서 파생된 pluripotent hESCs로 제한됩니다 이전 morula에서 파생된 동물 – 기원 ESCs, ESCs 등 다른 pluripotent 세포에 적용되지 않을 수도 있습니다 (8 셀) – 무대 배아 22, 그리고 인위적으로 다시 프로그램 세포 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP은 노화에 국립 연구소 (NIHK01AG024496)와 아동 건강 및 인간 발달의 유니스 케네디 Shriver 국립 연구소 (NIHR21HD056530)에서 건강 (NIH) 보조금의 국립 연구소에 의해 지원되었습니다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |