Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.
Bugüne kadar, uygun bir insan kalp hücresi kaynağı eksikliği, ya da hücre tabanlı nakli veya kalp doku mühendisliği 1-3, yenileyici insan miyokardın en büyük gerileme olmuştur . Kardiyomiyositlerde doğumdan kısa süre sonra ölümcül diferansiye olur ve tomurcuklanmaya yeteneğini kaybeder. , Kemik iliği veya kordon kanı diğer kaynaklardan elde edilen kök / progenitör hücreler, kalp içine 1-3 nakli sonrası kontraktil kalp kası hücreleri yol açmaları mümkün olduğunu, hiçbir kanıt yoktur. Hasar gören kalp kası yeniden veya onarım ihtiyacı, yetişkin kök hücre tedavisi, ya endojen veya 1-3 hücre teslim yoluyla karşılanmaktadır olmamıştır . Genetik istikrarlı bir insan embriyonik kök hücreleri (hESC) pluripotent, ihtiyaç soy sınırlı olan insan somatik hücre büyük malzemeleri, de vitro türetme için bir rezervuar proffering, sınırsız genişleme yeteneği ve sınırsız plastisiteonarım ve yenilenme 4,5. Donör organların sıkıntısı, dünya çapında ve akut kardiyovasküler hastalık yaygınlığı nedeniyle, alternatif bir yaklaşım olarak gelişmekte olan hESC tabanlı tedaviler yoğun ilgi var. Ancak, istenen bir fenotip pluripotent hESC geniş bir farklılaşma potansiyelinin verimli ve öngörülebilir bir kanal nasıl gelişim çalışma ve klinik çeviri için önemli bir sorun olmuştur. Geleneksel yaklaşımlar genellikle fenotipik heterojenite ve istikrarsızlık, dolayısıyla Tümör Gelişimi 6-8 riski yüksek (bkz. şematik bir takip verimsiz ve kontrol edilemeyen bir soy-taahhüt, pluripotent hücrelerin spontan germ tabakası farklılaşma ile çok soyundan eğim güveniyor Şekil 1A). Buna ek olarak, tanımsız / yabancı hayvan biyolojik takviyeleri ve / veya izolasyon, genişlemesi ve hESC farklılaşma için genellikle kullanılan besleyiciler doğrudan kullanımı gibi hücre-speciali yapabilir9-11 sorunlu hastalarda zed greft. Bu engellerin üstesinden gelebilmek için, biz de novo klinik uygun hESC türetme için bir platform olarak hizmet hESC epiblast pluripotence sürdürülmesi için gerekli ve yeterli tanımlanmış bir kültür sistemi unsurlarının çözülmesi ve etkili bir klinik ile ilgili soy doğru düzgün gibi hESC yönetmenlik var küçük moleküller tarafından 12 (Şekil şematik bir bakın. 1B). Küçük moleküller ve büyüme faktörleri çok çeşitli tarama sonra, söz konusu tanımlanmış koşullar nikotinamid (NAM) (Şekil 2, daha yüksek verimlilik ile üretilen insan yenerek kardiyomiyositlerde cardioblasts ilerledi pluripotent hESC doğrudan cardiomesoderm özellikleri ikna etmek için yeterli hale bulundu .) Biz bir iyi-kontrollü verimli türetme sağlayan, bir çok soyundan embriyoid vücut sahne olmadan doğrudan cardioblasts pluripotent hESC indüksiyonu için koşullar tanımlananhücre tabanlı tedavi için gelişim evreleri yelpazesinde insan kalp hücrelerinin büyük kaynağı.
Gelişimsel çalışma ve klinik çeviri için en büyük zorluklardan biri, verimli ve öngörülebilir bir insan pluripotent kök hücrelerinin istenen bir fenotip geniş bir farklılaşma potansiyeli nasıl kanal olmuştur. Bu hücrelerde, bir multi-dizi toplama aşamasında giderek tüm germ hücrelerine in vitro kendiliğinden ayırt rağmen hESC elde edilen sadece çok soyundan agrega (embriyoid organları), hücreler çok küçük bir fraksiyonu (<% 2) kendiliğinden kardiyomiyositlerde 13-15 (Şekil 1A) farklılaşırlar. Aşağıdaki immunoselection kardiyomiyositlerinin zenginleştirilmiş popülasyonları hayvan modellerinde 13 kalp içine enjeksiyonunu takiben, mekanik ve elektronik hasarlı miyokard fonksiyonu kurtarmak için biyolojik kalp pili olarak çalışması için başardık . Kemirgen enfarkte modelleri, engrafted hESC elde edilen kardiyak yavrularıyla hayatta ve 12 hafta kadar olgun ve kısmen remuscularyaralı kalp kasılma fonksiyonu 14,15 ize ve geliştirmek. Ancak, çok soyundan pluripotent hücreler farklılaşma ve Tümör Gelişimi aşağıdaki nakli yüksek risk ile insan kalp-taahhüt hücreleri üreten verimsizlik, ileri klinik çeviri engellemiştir. Sadece kalp fenotip ve öngörülebilir pluripotent hESC geniş bir farklılaşma potansiyeli kanal stratejileri geliştirme harnessing kalp alanında hESC biyoloji güç için hayati önem taşımaktadır. Belirli bir soydan insan pluripotent kök hücrelerinin düzgün bir dönüşüm elde etmek için, biz, sadece klinik olarak ilgili soy belirli bir pluripotent hESC iyi kontrollü verimli indüksiyonu için koşulları tanımlamak için farklılaşmamış hESC yayılması sigortalanması yeteneğine tanımlanmış bir kültür sistemi istihdam küçük moleküllerin basit bir hüküm (Şekil 1B) . Biz doğrudan p o nikotinamid bağlı kalp-dizi taahhüdüdaha yüksek verimlilik (Şekil 2) kardiyomiyositlerde yenerek ilerledikçe belirlenen kültür altında luripotent hESC. Nkx2.5 insan konjenital kalp hastalığı (KKH), en yaygın insan doğuştan gelen bir kusur 16 ile ilişkili olan genin normal kalp gelişimi ve mutasyonlar için vazgeçilmez bir evolutionally korunmuş homeobox transkripsiyon faktörü. Şimdiye kadar incelenen tüm omurgalıların İfadesi Nkx2.5 kalp habercisi hücreler için erken işaretleyici ve uygun kalp septasyon ve oluşumu / elektrik iletim sisteminin 16 olgunlaşması için gereklidir. Omurgalılarda, erken Nkx2.5 ifade başlangıçlı ve desen kabaca erken embriyogenez kalp şartname zamanlaması ve alanı ile örtüşmektedir ve Nkx2.5 gen kalp 16 geliştirilmesi yoluyla ifade edilmesi devam eder. HESC modeli, NAM, kalp-özel transcri ifade teşvik ederek pluripotent hESC doğrudan kalp indüksiyon tetiklemek için ortaya çıktıption faktör Nkx2.5 insan embriyonik cardiogenesis pluripotent epiblast cardiomesoderm özellikleri taklit edebilecek bir süreç. Gelecek çalışmalar, alternatif olarak rejeneratif tedaviler için klinik ile ilgili soy kaynaklanan küçük molekül aracılı hESC pluripotent kaderini doğrudan kontrolü ve modülasyon için önünü hangi insan kalp gelişiminde genetik ve epigenetik kontrol moleküller ortaya koyacaktır. NAM tedaviye gerek kalmadan, <% 2 hESC kardiyomiyositlerde 12-15 yenerek kendiliğinden farklılaşma uğrayacaktır. NAM tedavi ile, insan embriyonik kalp gelişimi 12 taklit edebilecek bir süreç tanımlamak kültürün etkisi altında muhafaza hESC>% 95>% 50 embriyonik kalp öncüleri ve dayak kardiyomiyositlerde oluşturmak mümkün olmuştur. Son zamanlarda, bilinen kalp-kaderini belirleyen genlerin <0.5% 17, 18 gibi düşük bir verimlilik ile doğum sonrası dayak kardiyomiyositlerde içine fare fibroblastlar transdifferentiate kullanılmıştır </> Destek. Ancak, reprogrammed somatik hücre tarihsel anormal gen ekspresyonu ve engelli terapötik yarar 19-21 ile hızlandırılmış yaşlanması ile ilişkili olmuştur. Son olarak, burada kurulan protokol, iç hücre kütlesinden (ICM) veya 4,5 insan blastosist epiblast elde edilen pluripotent hESC sınırlıdır önceki morula elde edilen hayvansal kaynaklı EKH, EKH dahil olmak üzere diğer pluripotent hücreler için geçerli olmayabilir (sekiz-cell)-dönem embriyoların 22, ve yapay reprogrammed hücreler 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP, Ulusal Sağlık (NIH), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIHK01AG024496) ve Eunice Kennedy Shriver Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü (NIHR21HD056530) hibe Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |