Мы создали протокол для индукции cardioblasts прямо из плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток человека поддерживается при определенных условиях с малыми молекулами, что позволяет вывод большой запас человеческой сердечной прародителей и функциональные кардиомиоциты для сердечно-сосудистой ремонта.
To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.
Одной из основных задач в области развития и исследования и клинические перевод был как канал широкие возможности дифференциации плюрипотентных стволовых клеток человека, чтобы желаемый фенотип эффективно и предсказуемо. Хотя такие клетки могут дифференцироваться спонтанно в пробирке в клетки всех зародышевых листков, пройдя через несколько линия совокупного этапе, в чЭСК полученных мульти-линии агрегаты (эмбриоидные тела), только очень небольшая часть клеток (<2%) спонтанно дифференцироваться в кардиомиоциты 13-15 (рис. 1А). После иммунологическая, обогащенного популяции кардиомиоцитов были в состоянии функционировать как биологические кардиостимуляторы, чтобы спасти функцию поврежденного миокарда механическим и электронным после инъекции в сердце животных моделях 13. В грызунов инфаркта моделей, привиты чЭСК происхождения сердечной потомства смогли выжить и зрелых до 12 недель, а частично remuscularИзе ранения сердца и улучшению сократительной функции 14,15. Тем не менее, неэффективность в формировании человека сердечно-совершенных клеток через мульти-линии дифференциации плюрипотентных клеток и высоким риском туморогенность после трансплантации препятствуют дальнейшие клинические перевода. Разработка стратегии обеспечения канал широкий потенциал дифференциации плюрипотентных ЭСК исключительно и предсказуемо для сердечной фенотипа является жизненно важным для использование энергии чЭСК биологии в самом сердце области. Для того чтобы добиться равномерно преобразования человека плюрипотентных стволовых клеток к определенной линии, мы использовали определенную культуру системы, способной страхования размножения недифференцированных ЭСК определить условия для хорошо контролируемых эффективной индукции плюрипотентных ЭСК исключительно частности клинически соответствующую линию от простого предоставления малых молекул (рис. 1б). Мы обнаружили, что никотинамид индуцированные сердечно-линии обязательств непосредственно из рluripotent ЭСК при определенных культурой, что дальнейший прогресс в избиении кардиомиоциты с высокой эффективностью (рис. 2). Nkx2.5 является эволюционно сохраняется фактор транскрипции гомеобокс необходимы для нормальной сердечной развития и мутации гена связаны с человеческим врожденным пороком сердца (ИБС), наиболее распространенный врожденный дефект человека 16. Выражение Nkx2.5 является самым ранним маркером клетки сердечной предшественником у всех позвоночных к настоящему времени изучены и является жизненно необходимым для сердечной septation и образование / созревания электрической проводимости системы 16. У позвоночных, начало и характер ранней Nkx2.5 выражении примерно совпадают со сроками и область сердечной спецификацию в начале эмбриогенеза, и Nkx2.5 ген продолжает быть выражены через развитие в сердце 16. В нашей модели чЭСК, ДН появился, чтобы вызвать сердечный индукции непосредственно из плюрипотентных ЭСК путем содействия выражение сердечной конкретных transcription фактор Nkx2.5 в процесс, который может эмулировать спецификации cardiomesoderm из плюрипотентных эпибласта в человеческих эмбриональных cardiogenesis. Будущие исследования позволят выявить генетические и эпигенетические молекул управления в развитии человека сердце в качестве альтернативы, которая может проложить путь для малых молекул-опосредованного прямого контроля и модуляции чЭСК судьба плюрипотентных при выводе клинически соответствующих линий для регенеративной терапии. Без лечения ДН, <2% ЭСК подвергнется спонтанной дифференцировке в кардиомиоциты избиения 12-15. При лечении ДН, мы были способны генерировать> 95% эмбриональной сердечной прекурсоров и> 50% кардиомиоцитов побои от ЭСК поддерживается под определить культуру в процесс, который может эмулировать человеческий эмбрионального развития сердца 12. В последнее время известные сердечно-судьба определения генов, были использованы для transdifferentiate фибробластов мыши в послеродовой избиения кардиомиоцитов с низкой эффективностью <0,5% 17, 18 </ SUP>. Тем не менее, перепрограммировать соматические клетки были исторически связаны с аномальной экспрессии генов и ускоренное старение с нарушением терапевтическую полезность 19-21. Наконец, протокол мы установили здесь ограничивается плюрипотентных ЭСК происходит от внутренней клеточной массы (ICM) или эпибласта из человеческой бластоцисты 4,5, могут не распространяться на другие клетки плюрипотентные, в том числе животного возникли эмбриональные клетки, ЭСК производным от ранее морулы (восемь-клетки) стадии эмбриона 22, и искусственно перепрограммировать клетки 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP было поддержано Национальным институтом здоровья (NIH) гранты от Национального института по проблемам старения (NIHK01AG024496) и Юнис Кеннеди Шрайвер Национального института детского здоровья и человеческого развития (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |