Überwachung des Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen unter Verwendung eines Degron (DGN)-destabilisiert Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Reporter Protein
Summary
Eine Methode, um Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen zu überwachen beschrieben. A Degron-destabilisierten GFP-(GFP-DGN) und eine stabile GFP-dgnFS Fusionsprotein erzeugt und transduziert in die Zelle mit einem lentiviralen Expressionsvektor. Diese Technik ermöglicht eine stabile GFP-dgn/GFP-dgnFS exprimierenden Zelllinie, in dem Ubiquitin-Proteasom-Aktivität leicht beurteilt werden kann, mit Epifluoreszenz oder Durchflusszytometrie generieren.
Abstract
Proteasome ist der wichtigste intrazelluläre Organellen in den proteolytischen Abbau von abnormal, fehlgefalteten, beschädigte oder oxidierte Proteine 1, 2 beteiligt. Wartung der Proteasom-Aktivität wurde in vielen wichtigen zellulären Prozessen beteiligt, wie Zelle Stressantwort 3, Regulation des Zellzyklus und Zelldifferenzierung 4 oder Reaktion des Immunsystems 5. Die Dysfunktion des Ubiquitin-Proteasom-System hat zu der Entwicklung von Tumoren und neurodegenerativen Krankheiten 4, 6 in Verbindung gebracht. Zusätzlich wurde eine Abnahme der Proteasom-Aktivität als Funktion der zellulären Seneszenz und organismal Alterung 7, 8, 9, 10 gefunden. Hier präsentieren wir eine Methode, um Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen mit einem GFP-dgn Fusionsprotein zu messen. Um Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden primären Zellen zu überwachen, konstruiert komplementäre DNA, die für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP)-dgn Fusionsprotein (GFP-dgn, instabil) und eine Variante Tragen einer Frameshift-Mutation (GFP-dgnFS, stabil 11) werden in lentiviralen Expressionsvektoren insertiert. Wir bevorzugen diese Technik gegenüber herkömmlichen Transfektionstechniken weil es eine sehr hohe Transfektionseffizienz garantiert unabhängig von dem Zelltyp oder dem Alter des Spenders. Der Unterschied zwischen der Fluoreszenz, die von GFP-dgnFS (stabilen) Protein und dem destabilisierten Protein (GFP-dgn) in Abwesenheit oder Gegenwart von Proteasom-Inhibitor angezeigt kann zum Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in jeder bestimmten Zellstamm abzuschätzen. Diese Unterschiede können durch Epifluoreszenzmikroskopie überwacht werden können oder mittels Durchflusszytometrie gemessen werden.
Protocol
Discussion
Die erste Veröffentlichung mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) als Reporter Substrat für Ubiquitin-Proteasom-Aktivität wurde in 2000 12 veröffentlicht. Seitdem hat GFP zu einem gemeinsamen Instrument zur zellulären Aktivitäten, insbesondere das Ubiquitin-Proteasom-Prozess zu visualisieren. Um Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in vivo zu überwachen ein transgenes Mausmodell mit einem GFP-basierte Reporter wurde 13 eingeführt. Zusätzliche in vivo Forschung etabliert ander…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde gefördert durch: National Research Network on Aging (NFN S93) von der österreichischen Science Foundation (FWF), Europäische Kommission Integrierte Projekte MiMAGE und PROTEOMAGE, Niederlande Genomics Initiative / Niederländische Organisation für wissenschaftliche Forschung (NGI / NWO, 05040202 und 050 – 060-810 NHG), das EU Network of Excellence Lebensdauer (FP6 036.894) finanziert und Innovation Oriented Research Program am Genomics (SenterNovem; IGE01014 und IGE5007).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 |
| pENTR Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 |
| pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 |
| Lipofectamine 2000 Reagent | Invitrogen | 11668019 |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| PVDF filter (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 |
| Polyethylene glycol | Sigma | P2139 |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 |
| hexadimethrine bromide | Sigma | 10,768-9 |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 |
| Crystal violet | Sigma | C3886 |
| FACS tubes | BD Biosciences | |
| Penicillin Streptomycin (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 |
| L-glutamine 200 mM | Invitrogen | 25030024 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom AG | S0115 |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 |
| MEM Sodium Pyruvate 100 mM | Invitrogen | 11360039 |
| D-(+)-Glucose (45%) | Sigma | G8769 |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 |
| CaCl2 | Merck | C5080 |
| Hepes | Sigma | H3375 |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300054 |
References
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V. The ubiquitin-proteasome pathway and endothelial (dys)function. Cardiovasc. Res. 85, 281-290 (2009).
- Tuoc, T. C., Stoykova, A. Roles of the ubiquitin-proteosome system in neurogenesis. Cell Cycle. 9, 3174-3180 (2010).
- Rock, K. L., et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules. Cell. 78, 761-771 (1994).
- Lehman, N. L. The ubiquitin proteasome system in neuropathology. Acta Neuropathol. 118, 329-347 (2009).
- Koziel, R., Greussing, R., Maier, A. B., Declercq, L., Jansen-Durr, P. Functional Interplay between mitochondrial and proteasome activity in skin aging. J. Invest. Dermatol. 131, 594-603 (2010).
- Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Jansen-Durr, P. Post-translational modification of cellular proteins by ubiquitin and ubiquitin-like molecules: role in cellular senescence and aging. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 172-196 (2010).
- Bulteau, A. L., Szweda, L. I., Friguet, B. Age-dependent declines in proteasome activity in the heart. Arch. Biochem. Biophys. 397, 298-304 (2002).
- Strucksberg, K. H., Tangavelou, K., Schroder, R., Clemen, C. S. Proteasomal activity in skeletal muscle: A matter of assay design, muscle type, and age. Anal. Biochem. , (2009).
- Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
- Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
- Lindsten, K., Menendez-Benito, V., Masucci, M. G., Dantuma, N. P. A transgenic mouse model of the ubiquitin/proteasome system. Nat. Biotechnol. 21, 897-902 (2003).
- Liu, J., et al. Impairment of the ubiquitin-proteasome system in desminopathy mouse hearts. FASEB J. 20, 362-364 (2006).
- Bowman, A. B., Yoo, S. Y., Dantuma, N. P., Zoghbi, H. Y. Neuronal dysfunction in a polyglutamine disease model occurs in the absence of ubiquitin-proteasome system impairment and inversely correlates with the degree of nuclear inclusion formation. Hum. Mol. Genet. 14, 679-691 (2005).
- Myung, J., Kim, K. B., Lindsten, K., Dantuma, N. P., Crews, C. M. Lack of proteasome active site allostery as revealed by subunit-specific inhibitors. Mol. Cell. 7, 411-420 (2001).
- Menendez-Benito, V., Heessen, S., Dantuma, N. P. Monitoring of ubiquitin-dependent proteolysis with green fluorescent protein substrates. Methods Enzymol. 399, 490-511 (2005).
- Lener, B., et al. The NADPH oxidase Nox4 restricts the replicative lifespan of human endothelial cells. Biochem. J. 423, 363-374 (2009).
