Suivi de l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes aide d'un Degron (dgn)-déstabilisé Green Fluorescent Protein Reporter Protéines (GFP) à base de

Summary

Procédé pour surveiller l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes est décrit. Un degron-GFP déstabilisée-(GFP-dgn) et une protéine de fusion GFP-stable dgnFS sont générés et transduites dans la cellule en utilisant un vecteur d'expression lentiviral. Cette technique permet de générer une lignée stable de cellules exprimant GFP-dgn/GFP-dgnFS dans lequel l'activité ubiquitine-protéasome peut être facilement évaluée en utilisant épifluorescence ou la cytométrie en flux.

Abstract

Protéasome est la principale organite intracellulaire impliquée dans la dégradation protéolytique de la anormaux, mal repliées, les protéines endommagées ou oxydées ^{1, 2.} Maintien de l'activité du protéasome est impliqué dans de nombreux processus cellulaires clés, comme la réponse au stress cellulaire ^3, la régulation du cycle cellulaire et de la différenciation cellulaire ⁴ ou en réponse du système immunitaire ^5. Le dysfonctionnement du système ubiquitine-protéasome a été associée à l'apparition de tumeurs et de maladies neurodégénératives ^{4, 6.} En outre, une diminution de l'activité du protéasome a été trouvé comme une caractéristique de la sénescence cellulaire et organismique vieillissement ^{7, 8, 9, 10.} Ici, nous présentons une méthode pour mesurer l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes en utilisant une protéine de fusion GFP-dgn. Pour être en mesure de surveiller l'activité ubiquitine-protéasome dans les cellules vivantes primaires, construit d'ADN complémentaire codant pour une protéine fluorescente verte (GFP)-dgn protéine de fusion (GFP-dgn, instable) et une variante portant une mutation du cadre de lecture (GFP-dgnFS, stable ¹¹⁾ sont insérés dans des vecteurs d'expression lentiviral. Nous préférons cette technique par rapport aux techniques de transfection traditionnels, car il garantit une efficacité de transfection très élevée indépendamment du type de cellule ou de l'âge du donateur. La différence entre la fluorescence émise par la GFP-dgnFS (stable) et la protéine déstabilisé (GFP-dgn) en l'absence ou en présence de l'inhibiteur de protéasome peuvent être utilisées pour estimer l'activité ubiquitine-protéasome dans chaque souche cellulaire particulier. Ces différences peuvent être surveillés par microscopie à épifluorescence ou peut être mesurée par cytométrie en flux.

Protocol

1. Construction des plasmides

1. Afin personnalisé oligo-nucléotides codant pour dgn (ACKNWFSSLSHFVIHL ¹¹⁾ et pour dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) et le ligaturer dans le vecteur pEGFP-C1 afin d'obtenir la fusion de la GFP avec dgn / dgnFS (figure 1).
2. Amplifier la séquence codant pour la GFP-dgn et GFP-dgnFS par PCR selon le protocole du kit de clonage TOPO directionnel pENTR et continuer avec le kit TOPO directionnel pLenti6/V5 clonage (figure 6).

2. Production de virus

1. Le jour avant la transfection (Jour 1) de graines sur les cellules HEK 293FT dans un des flacons....

Discussion

La première publication en utilisant la protéine fluorescente verte (GFP) comme substrat reporter pour l'activité ubiquitine-protéasome a été publié en 2000 ^12. Depuis lors, la GFP est devenu un outil commun de visualiser les activités cellulaires, en particulier le processus ubiquitine-protéasome. Pour surveiller l'activité ubiquitine-protéasome in vivo d'un modèle de souris transgénique avec un rapporteur GFP basée a été mis en place ^13. Autres recherches in vivo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
pEGFP-C1 Vecteur	BD Bioscience Clontech	6084-1
pENTR Directional TOPO Cloning Kit	Invitrogen	K2400-20
pLenti6/V5 Directional TOPO Cloning Kit	Invitrogen	V496-10
Lipofectamine 2000 réactif	Invitrogen	11668019
DMEM	Sigma	D5546
Filtre PVDF (Rotilabo-Spritzenfilter)	Roth	P667.1
Polyéthylène glycol	Sigma	P2139
NaCl	Merck	1.06404.1000
Phosphate de Dulbecco tamponnée Saline 1x (PBS)	Invitrogen	14190
hexadiméthrine bromure de	Sigma	10,768-9
Blasticidine	Invitrogen	R21001
Cristal violet	Sigma	C3886
FACS tubes	BD Biosciences
La streptomycine Pénicilline (Pen-Strep)	Invitrogen	15140130
L-glutamine 200 mM	Invitrogen	25030024
Sérum foetal bovin (FBS)	Biochrom AG	S0115
MEM non-acides aminés essentiels (AANE) 100x	Invitrogen	11140035
Pyruvate de sodium 100 mM MEM	Invitrogen	11360039
D-(+)-glucose (45%)	Sigma	G8769
Généticine	Invitrogen	11811023
CaCl2	Merck	C5080
Hepes	Sigma	H3375
Trypsine-EDTA (0,05%)	Invitrogen	25300054